酵母菌的简单染色和血细胞计数板计数

用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等
的计数。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四 个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短 横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每
个方格网共分9个大方格，中央的一大方格作计数室。
•
计数区的刻度有两种：一种是计数区分为 16个中
个小格），位于格线上的菌体一般只数上方和右边线
上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时， 即作两个菌体计数。 遵循“数上不数下，数左不数右”的原则。 计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样 品的含菌量。
4、清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上 用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风 机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其化沉淀 物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3， 每 个 小 方 格 的 体 积 为 1 / 4 0 0 0 m m
3
。
• 计数时，通常数5个中方格的总菌数（四角中格及中间中 格），然后求得每个中方格的平均值，再乘以25或16，就 得出一个大方格的总菌数，然后在换算成1ml菌液中的总
菌数。
方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成
25 个小方格；另一种是一个计数区分成 25 个中方格
（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成
16 个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们
都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个
小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区
4 、染色30分钟后再次观察注意死活细胞比例是否发生变化。
获得本次实验成功的关键
⑴ 活细胞是透明的，因此在进行显微镜计数应适当减低视野亮度，以增大反差。
⑵进行显微计数时应现在低倍镜下寻找大方格的位置，找到计数室后将其移至
视野中心，再换高倍镜观察和计数。 ⑶用接种环将菌体与染液混合时不要剧
烈涂抹，以免破坏细胞。 ⑷滴加染液要适中，否则要盖玻片覆盖时。染液过
• 以25个中方格的计数板为例，设5个中方格的总菌数为A， 菌液稀释倍数为B，则
• 1ml菌液中的总菌数=A/5×25×104×B
实验步骤一
1、检查血细胞计数板 在加样前，对计数室进行镜检。若有污物，可用自来水清洗，
再用95%的乙醇棉球轻轻擦洗。然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。 注意：计数板上的技术室的刻度非常精细，清洗时切勿使用刷 子等硬物，也不可用酒精灯火焰烘烤计数板。 2、加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细 口滴管将稀释摇匀的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过 多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数 室均能充满菌液。注意不可有气泡产生，静置5—10分钟即可计
实 验 五
酵母菌的简单染色和 血细胞计数板计数 第五组
实验目的
一、学习使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量 的方法。 二、初步了解酵母菌的形态特征和区分死活细胞。
三、巩固显微镜操作技术。
实验材料
菌种：酿酒酵母
溶剂和试剂：生理盐水、吕氏碱性美蓝染液
仪器和其他用品：普通光学显微镜，血细胞计数板、载玻片、盖 玻片、接种环、酒精灯、三角烧瓶。
3、显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物台上，先
用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行
计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节 稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5—10个菌体为宜。若选用25×16规格的计数板则每个 计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80
1mm
实验步骤二
美蓝染液水浸片法
1、滴加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染液于载玻片中央，于酿酒酵母合成培 养基中蘸取少量菌体置于染液中混合均匀。 2、用镊子取一片盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾 斜并覆盖在菌液上。 3、低倍镜及高倍镜镜检：将制片放置3分钟，观察酵母菌形态和出芽情
况，并根据颜色区分。⑸ 盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。
your time
实验原理二
• 酵母菌是不运动的单细胞真菌，圆形、卵圆形或圆柱形。 细胞大小为1-5mm×5-30mm，大多数酵母菌以出芽方式进 行无性繁殖，有性繁殖通过接合产生子囊孢子。 • 美蓝是一种无毒性的染料。它的氧化型呈蓝色，还原型无 色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈 代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色 的氧化型变为无色的还原型。因此酵母活细胞是无色的， 而死细胞或衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，以此进行鉴别。
显微镜计数法：显微镜计数法是将少量待测样品的悬 浮液置于一种特定的具有确定容积的载玻片上（又称计菌 器），与显微镜下观察、计数的方法。 计菌器种类：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器、
Hawksley计菌器（基本原理相同
）
实验原理一
血细胞计数板（最常用也是本实验所用）：较厚，不能使