实验五 线粒体的分离与观察共27页文档
实验五 叶绿体的分离与荧光观察
实验五叶绿体的分离与荧光观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。
由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。
叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
二、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35 mol／L氯化钠或0.4 mol／L蔗糖溶液)中进行．以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000 r／min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。
然后，在3000 r／min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。
某些物质在一定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光．这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
实验五 线粒体与液泡系的。。。
线粒体和液泡系的超活染 色与观察
一、实验目的
• 1 ．观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的 形态、发育和分布；
• 2 ．了解细胞和细胞器的超活染色技术
二、实验原理
• 詹纳斯绿Ｂ可专一性地对对线粒体进行活染,这是
由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染 料始终保持氧化状态(即有色状态),呈蓝绿色。
15000詹纳斯绿b溶液12滴于载玻片上撕取一片洋葱鳞茎内表皮载玻片于37恒温水浴染色1015min用吸管吸去软液加上ringer液盖上盖玻片显微镜下观初生绿豆幼苗根尖12cm纵切面切片13000中性红溶液1滴染色510min载玻片于37恒温水浴吸去软液加上ringer液盖上盖玻片用镊子轻压盖片使根尖压扁显微镜下观察
洋葱Байду номын сангаас茎表皮细胞线粒体
五、作业
• 1 ．绘出人口腔上皮细胞示线粒体的形态与
分布并简要分析。 • 2 ．绘出绿豆幼根根尖组织液泡系的形态与
分布并简要分析 。
1、口腔上皮细胞几乎不呈具体形状，方型，片状。 很大，经染色后可见一蓝色偏红的细胞核，很大； 有的细胞见不到细胞核。几乎见不到线粒体，只有1个片子在 细胞核周围看见2-3个棍棒状的蓝色形体，为线粒体？形状小 2、洋葱内表皮细胞近似小房子，只有一个片子看到一椭圆形 蓝色形体，其内模糊看见弯曲的褶痕。另外，能看见细胞膜 与细胞壁界限，细胞壁方形，细胞膜似镶嵌其中的大泡 3、绿豆嫩芽细胞也近似小房子，在细胞膜附近及外部有众多 小泡泡，高尔基分泌小泡？
四、实验方法
• （一）线粒体的超活染色与观察 • 1 ．口腔上皮细胞线粒体的超活染色 • 1/5000詹纳斯绿Ｂ 2滴，口腔上皮细胞（牙签刮取），载 玻片于37℃恒温水浴染色10-15min，盖上盖玻片，用吸 水纸吸去多余的水分，显微镜下观察． • 2 ．洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察 • 1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液１-2滴于载玻片上，撕取一片洋葱 鳞茎内表皮，载玻片于37℃恒温水浴染色10-15min，用 吸管吸去软液，加上 Ringer液，盖上盖玻片，显微镜下观 察． • （二） 绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察 • 初生绿豆幼苗根尖（１－２cm）纵切面切片，1/3000中 性红溶液１滴染色5-10min，载玻片于37℃恒温水浴，吸 去软液，加上 Ringer液，盖上盖玻片用镊子轻压盖片，使 根尖压扁，显微镜下观察．
观察线粒体实验报告
观察线粒体实验报告观察线粒体实验报告线粒体是细胞中的一个重要细胞器，它在细胞内扮演着能量生产的关键角色。
为了深入了解线粒体的结构和功能，我们进行了一系列的线粒体实验观察。
本报告将详细介绍我们的实验过程和观察结果。
实验一：线粒体的形态观察我们首先使用显微镜对线粒体进行了形态观察。
通过细胞染色和显微镜放大，我们清晰地观察到了细胞质中的线粒体。
线粒体呈椭圆形或长圆形，大小约为1-10微米。
我们还发现，线粒体表面覆盖着一层光滑的膜，使其在细胞内具有良好的运动能力。
实验二：线粒体的功能观察为了进一步了解线粒体的功能，我们进行了线粒体的呼吸作用实验。
通过添加适当的底物和试剂，我们观察到线粒体产生了大量的ATP分子，这是细胞内能量的主要来源。
这表明线粒体在细胞内起着重要的能量转换作用。
实验三：线粒体与细胞凋亡的关系线粒体在细胞凋亡过程中也发挥着重要作用。
我们进行了线粒体与细胞凋亡关系的实验观察。
通过添加特定的药物，我们诱导了细胞凋亡，并观察到线粒体内的某些蛋白质释放到细胞质中。
这些蛋白质的释放触发了一系列的细胞凋亡信号，导致细胞死亡。
这个实验结果进一步证明了线粒体在细胞凋亡中的重要性。
实验四：线粒体与遗传疾病的关系线粒体还与一些遗传疾病的发生有关。
我们进行了一项实验，观察了线粒体DNA的突变对细胞功能的影响。
通过引入突变的线粒体DNA到细胞中，我们观察到细胞的能量代谢受到了明显的影响，导致细胞功能异常。
这一实验结果揭示了线粒体突变与一些遗传疾病的关联。
实验五：线粒体与老化的关系线粒体在细胞老化过程中也扮演着重要角色。
我们进行了一项实验，观察了线粒体功能与细胞老化之间的关系。
通过测量线粒体的呼吸作用和ATP产量，我们发现随着细胞的老化，线粒体功能逐渐下降，导致细胞能量供应不足。
这一实验结果进一步证明了线粒体在细胞老化中的重要性。
总结：通过一系列的线粒体实验观察，我们深入了解了线粒体的结构和功能。
线粒体不仅在细胞能量代谢中起着重要作用，还与细胞凋亡、遗传疾病和细胞老化等过程密切相关。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的 25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内惟一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今向来是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或者万转/分离心机。
2.组织捣碎机或者匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布(尼龙布)、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器(氧极普测试系统)。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl (0.05M，pH7.2)缓冲液。
3.磷酸缓冲液(0.2M，Ph7.2)。
4.提取洗涤液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇 (0.35M)、牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml)，EDTA (0.001M)，TriS-HCl (0.01M，pH7.2)缓冲液。
5.悬浮液(同试剂 4，但不加 BSA)。
6.反应液：在 1000ml 溶液中含有甘露醇(0.35M)、蔗糖(0.25M)、KCl (10ml，pH7.2)、EDTA (0.2mM)、MgCl2 (5mM)、TriS-HCl (10mM，pH7.2)。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素 (物理和化学的)作用而失活，特殊是膜的完整性极其重要，因为惟独完整的线粒体才干进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下(0-4 o C)进行。
[2].要注意分离介质的 pH 值， pH 值应和被采用的材料一致。
实验五用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与讨论
01 实验目的
掌握高倍显微镜的使用方法
熟悉显微镜的结构和 操作步骤，包括调节 焦距、对光、移动载 玻片等。
了解显微镜的保养和 维护，确保实验结果 的准确性和仪器的使 用寿命。
用纸巾轻轻按压盖玻片，去除多余的 液体。
用镊子夹取染色后的组织块，放在载 玻片上，盖上盖玻片。
用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
将制作好的临时装片放在显微镜 的载物台上。
调整显微镜的焦距，使观察到的 图像清晰。
仔细观察叶绿体和线粒体的形态、 分布和数量。
记录观察结果
01
用笔记录观察到的叶绿体和线粒体的形态、分布和 数量。
高倍显微镜的工作原理
高倍显微镜是一种光学仪器，通过透镜的放大作用，将微小的物体放大并清晰地呈 现出来。
高倍显微镜通常配备有多个透镜，包括物镜、目镜和聚光镜等，以实现更高的放大 倍数和更好的观察效果。
在观察叶绿体和线粒体时，高倍显微镜能够提供足够的放大倍数和分辨率，使观察 者能够清晰地看到它们的形态和分布。
掌握高倍显微镜的使 用技巧，如选择合适 的放大倍数、调整光 圈大小等。
了解叶绿体和线粒体的形态和分布
通过观察不同植物或组织切片， 了解叶绿体和线粒体的形态特征，
如大小、形状、数量等。
学习如何识别和区分叶绿体和线 粒体，了解它们在细胞内的分布
情况。
了解叶绿体和线粒体在不同类型 细胞中的差异分布和功能特点。
培养实验操作技能和观察能力
通过实验操作，培养学生对微 观世界的观察能力和动手能力。
训练学生使用显微镜进行观察、 记录和分析实验结果的能力。
细胞核和线粒体的分离和观察
结果： 描述5张涂片镜下情况
单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，请尽量言简 意赅地阐述观点。
讨论：
一． 实际情况和理论预期是否符合？为什么？ 二． 本实验步骤有哪些可以改进的地方？
二、实验原理
杆状玻璃匀 浆器法
融法
超声波处理 法
细胞破碎的方法
#2022
细胞破碎的注意事项：
二、实验原理
（二）分离纯化的方法
根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞 组分分离过程中最广泛应用的技术
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差 异进行分离、浓缩和提纯的一种方法
布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒 体 显 色 ， 而 胞 质 中 的 染 料 被 还 原 成 无 色 。 （ 也 可 使 用 罗 丹 明 1 2 3 或 M i t o Tr a c k e r 等 荧 光 探针标记法等） 细胞核：DNA——亚甲基蓝、甲苯胺蓝、Hoechst染料等
滤液以 2500rpm，离 心15分钟；
一．缓缓取上清液，移入高速离 心管中，保存于有冰块的烧杯 中，待分离线粒体用；
二．同时涂一张上清液片②做好 标记，自然干燥；
三．余下的沉淀物进行下一步骤。
用6ml 蔗糖一Tris-HCI溶液悬浮沉淀 物，以2500rpm离心15分钟弃上清， 将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴 于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
03
缺点是：①分离效果差，不 能一次得到纯颗粒；须经反 复悬浮和离心加以纯化。② 壁效应严重，特别是当颗粒 很大或浓度很高时，在离心 管一侧会出现沉淀；③颗粒 被挤压，离心力过大、离心 时间过长会使颗粒变形、聚 集而失活。
实验五线粒体与液泡系的课件
液泡系包括细胞核外的所有液泡，是细胞内储存和调节物质 的细胞器，可以调节细胞内的渗透压、离子浓度等。
线粒体与液泡系的功能
线粒体的功能
线粒体的主要功能是通过氧化磷酸 化过程产生ATP，为细胞提供能量。 此外，它还参与细胞分化、信号转 导、细胞自噬等过程。
液泡系的功能
液泡系的主要功能是调节细胞内 外的物质交换，维持细胞的渗透 压和pH值平衡，同时参与消化、 分解、排泄等生理过程。
果。
结果分析
对观察结果进行分析， 得出结论。
04 线粒体与液泡系在生物学 中的应用
线粒体与疾病的关系
线粒体与神经退行性疾病
线粒体功能障碍与阿尔茨海默病、帕 金森病等神经退行性疾病的发生和发 展密切相关。
线粒体与心血管疾病
线粒体与癌症
线粒体功能障碍可影响细胞凋亡和增 殖，与癌症的发生和发展有关。
线粒体功能障碍可导致心肌缺血、心 肌肥厚等心血管疾病的发生。
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实验五线粒体与液泡 系的课件
目录
CONTENTS
• 线粒体与液泡系的概述 • 线粒体的实验观察 • 液泡系的实验观察 • 线粒体与液泡系在生物学中的应用 • 线粒体与液泡系的未来研究方向
01 线粒体与液泡系的概述
线粒体与液泡系的定义
线粒体
线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器 ，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场 所，被称为“power house”。
05 线粒体与液泡系的未来研 究方向
线粒体功能的深入研究
总结词
深入探索线粒体的功能和作用机制，研究其在细胞能量代谢、细胞凋亡等过程中 的作用。
详细描述
随着对线粒体研究的深入，人们逐渐认识到线粒体在细胞中的重要地位。未来研 究将进一步揭示线粒体的功能和作用机制，包括其在细胞能量代谢、细胞凋亡、 自噬等过程中的具体作用，以及与其他细胞器的相互作用。
线粒体的分离与鉴
•
• 三、实验材料 • (一) 材料 猪肝 • （二）器材 冷冻高速离心机、解剖刀剪、 小烧杯、冰浴、漏斗、匀浆器等。 • （三）试剂 • 1.0.9%灭菌的生理盐水。 • 2. 1%詹纳斯绿 B 染液。 • 3. 0.25mol/L 蔗糖缓冲液 • 4. 0.34mol/L 蔗糖缓冲液 • 5.固定液：甲醇：冰醋酸(9：1) • 6.姬姆萨染液
• 六、注意事项
• 1. 注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间， 整个分离过程不宜过长，以保持组分的生理活性。 最好在在 0～4℃或冰浴中进行。
• 2. 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加 入，同时及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下 沉过快，影响后面的离心分层效果。 • 3. 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果 较好。
• 七、作业
• 1. 线粒体提取分离过程中，为什么要在 0～4℃ 进行？
• 2. 将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查 是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒 体的纯度。要获得高活性的线粒体，在线粒体提 取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？ 根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方 法。
• 四、实验操作 • 1. 制备肝细胞匀浆： • 称取肝组织 20g，剪碎，用预冷到 0～ 4℃的0.25mol/L 缓冲蔗糖溶液洗涤数次。 然后在 0～4℃条件下，按每克肝加 5ml 冷 的0.25mol/L 蔗糖缓冲溶液将肝组织匀浆化， 蔗糖溶液应分数次添加。匀浆液用 两层纱 布过滤备用。
• 2. 离心：先将 5ml 0.34mol/L 缓冲蔗糖溶
• •
•
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗 粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而 分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次 是线粒体。
实验五：小鼠肝细胞线粒体超活染色及观察
实验五：小鼠肝细胞线粒体超活染色及观察一、实验目的1、掌握解剖小鼠的基本技术与方法；2、掌握线粒体的超活染色原理及方法；3、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。
二、实验原理1、线粒体线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。
细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。
活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。
詹纳斯绿B（JanusgreenB）是线粒体的专一性活体染色剂。
线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。
在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。
线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。
2、活体染色活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。
活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。
碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。
但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。
一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。
植物细胞线粒体实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习使用显微镜观察植物细胞线粒体的形态和分布。
2. 了解线粒体在植物细胞中的功能及其重要性。
3. 培养实验操作技能，提高观察和分析能力。
二、实验原理线粒体是植物细胞中的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为细胞的“动力工厂”。
线粒体具有双层膜结构，外膜光滑，内膜向内折叠形成嵴，线粒体基质中含有与有氧呼吸相关的酶类。
本实验通过观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体，了解其在植物细胞中的分布和形态。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱鳞片叶、生理盐水、碘液、盖玻片、载玻片、显微镜等。
2. 仪器：显微镜、解剖镜、酒精灯、镊子、剪刀、滴管、吸水纸等。
四、实验步骤1. 准备洋葱鳞片叶：取洋葱鳞片叶，用剪刀将其剪成薄片。
2. 制备临时装片：将洋葱鳞片叶薄片放置在载玻片上，滴加少量生理盐水，用镊子轻轻压扁，盖上盖玻片。
3. 染色：在盖玻片边缘滴加碘液，用吸水纸吸引碘液浸润整个装片。
4. 观察：将装片置于显微镜下，观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体。
5. 记录：记录线粒体的形态、分布和数量。
五、实验结果与分析1. 线粒体形态：观察到的线粒体呈圆形、椭圆形或短棒状，直径约为0.5-1.0微米。
2. 线粒体分布：线粒体主要分布在细胞质基质中，靠近细胞壁，细胞核周围较少。
3. 线粒体数量：每个细胞中观察到10-20个线粒体。
通过观察，我们发现洋葱鳞片叶细胞中的线粒体形态规则，分布均匀，说明线粒体在植物细胞中具有重要作用。
线粒体作为细胞的“动力工厂”，在细胞进行有氧呼吸过程中，将有机物氧化分解，产生能量，满足细胞生命活动的需要。
六、实验结论1. 植物细胞中的线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，为细胞提供能量。
2. 线粒体在植物细胞中的形态和分布具有规律性，对细胞生命活动具有重要意义。
3. 本实验通过观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体，掌握了显微镜的使用方法，提高了观察和分析能力。
七、实验讨论1. 线粒体在不同植物细胞中的形态和分布是否存在差异？2. 线粒体在植物细胞中的功能有哪些？3. 如何提高观察植物细胞线粒体的效果？八、实验反思本次实验中，我们通过观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体，了解了线粒体在植物细胞中的功能及其重要性。
实验五线粒体的分离与观察
2023
对分离得到的线粒体进行活性鉴定。
01
掌握用差速离心技术分离制备线粒体的方法。
02
一、实验目的
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释放出来。
01
细胞内不同结构的细胞器大小密度存在差异，因此不同细胞器在介质中的沉降系数各不相同。根据这一原理，常用不同转速的离心法来分离不同的细胞器。分级分离的方法有差速离心和密度梯度离心两种。
02
二、实验原理
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化.
1
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离技术。
2
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
3
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
实验五 叶绿体的分离
山东大学实验报告2013年3月12 日姓名李某某系年级同组者科目细胞生物学实验题目叶绿体的分离、纯化与荧光观察学号201100140000【实验目的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
【实验原理】1.叶绿体分离原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。
差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、差速离心特点：1.介质密度均一；2.速度由低到高，逐级离心。
用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。
沉降顺序：细胞核—线粒体—溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核蛋白体。
可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
3、密度梯度离心密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。
实验五用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体
➢ 使用高倍显微镜观察叶绿体、线粒体 的形态和分布
实验原理：
一、观察叶绿体
➢ 叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质中，呈绿色、扁平的 椭球形和球形 可在高倍显微镜下直接观察它的形态和分布
二、观察线粒体
线粒体普遍存在于植物细胞和动物细胞中，线粒体形态多 样，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等
健那绿染液 生活状态的线粒体
实验步骤：
（2）线粒体的观察（人口腔上皮细胞）
在洁净的载玻片中央滴1滴健那绿染液。
用消毒牙签钝端刮自己漱净的口腔内侧壁 上轻轻地刮几下
把牙签附着有碎屑的一端，放在染液中涂 抹几下，5min后，盖上盖玻片，用吸水纸 吸去多余的染料
观察：先低倍镜后高倍镜，线粒体被染成蓝绿色， 细胞质接近无色
高倍显微镜下的线粒体（已染色）
实验材料：人口腔上皮细胞和洋葱鳞片叶内表皮
实验步骤：
（一）叶绿体的观察
在洁净的载玻片中央滴一滴清水，用镊子取 一片黑藻的叶，放在载玻片上的水滴中，盖 上盖玻片，制成临时装片。
将制作好的临时叶片装片放在显微镜下用低 倍镜观察，找到叶片细胞后换用高倍镜观察。
高倍显微镜下的黑藻叶绿体
实验步骤：
（二）线粒体的观察（洋葱鳞片叶内表皮）
在洁净的载玻片中央滴1~2滴健那绿染液。
用刀片在洋葱鳞片叶内表皮细胞中画一“#” 字（边长约5mm)。沿着“#”字的一角撕取 一小块洋葱内表皮。 将撕取的洋葱鳞茎内表皮放到载玻片上， 叶肉面朝下漂浮于染液上。染色5min,盖上 盖玻片，用吸水纸吸去多余染液。
观察：先低倍镜后高倍镜，线粒体被染成蓝绿色， 细胞质接近无色
05 小鼠肝细胞及精子线粒体的超活染色及观察
山东大学实验报告2018年4月16日________________________________________ _________________________姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：小鼠肝细胞及精子线粒体的超活染色及观察学号：201600140055一、目的要求1. 掌握线粒体的超活染色原理及方法2. 观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量和分布3. 观察小鼠精子的形态并尝试寻找畸形精子4. 观察小鼠精子中线粒体的分布二、实验原理1、线粒体线粒体(mitochondrion)是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为“power house”。
其直径在0.5到1.0微米左右。
除了溶组织内阿米巴、篮氏贾第鞭毛虫以及几种微孢子虫外，大多数真核细胞或多或少都拥有线粒体，但它们各自拥有的线粒体在大小、数量及外观等方面上都有所不同。
线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。
除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
不同生物的不同组织中线粒体数量的差异是巨大的。
有许多细胞拥有多达数千个的线粒体（如肝脏细胞中有1000-2000个线粒体），而一些细胞则只有一个线粒体（如酵母菌细胞的大型分支线粒体）。
大多数哺乳动物的成熟红细胞不具有线粒体。
一般来说，细胞中线粒体数量取决于该细胞的代谢水平，代谢活动越旺盛的细胞线粒体越多。
线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基部；在精子中分布在鞭毛中区。
在卵母细胞体外培养中，随着细胞逐渐成熟，线粒体会由在细胞周边分布发展成均匀分布。
线粒体在细胞质中能以微管为导轨、由马达蛋白提供动力向功能旺盛的区域迁移。
实验五叶绿体的分离与荧光观察
一. 实验目的
• 1 ．通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞 器分离的一般原理与方法；了解差速离心 Differential centrifugation特点与用途
• 2 ．了解菠菜叶绿体的形态、分布与数量。
二 实验原理
• 采用差速离心分离细胞器；
– 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶 体——内质网与高基体——核蛋白体；
• 2．材料
– 新鲜菠菜叶
• 3．试剂
– 氯化钠溶液
四、实验方法
• （一）叶绿体的分离与观察 1. 取新嫩菠菜叶，洗净檫干、去梗，称30g，分批放入研钵。 2. 加入氯化钠溶液， 共150ml，研磨，制成匀浆； 3. 将匀浆用６层纱布过滤于烧杯中； 4. 取滤液４ml在1000r/min离心２min，取上清； 5. 上清液3000r/min离心５min．去上清，沉淀即为叶绿体； 6. 加氯化钠溶液悬浮沉淀； 7. 取叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片： 8. 普通光镜下观察；荧光显微镜下演示 • （二）菠菜叶徒手切片观察 • 新嫩菠菜叶斜切面１片，氯化钠溶液１滴；加盖片轻压：光镜下观察叶绿体
在表皮细胞和保卫细胞中的分布；荧光显微镜下演示。
五 实验结果与分析
• 1．简述：叶绿体的分离原理和方法； • 2 ．绘图：菠菜叶肉细胞的形态，显示叶绿
体。
The End
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期待您的指正！
• 叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。 • 菠菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察 其形态
和分布；
Differential centrifugation
High speed
Low speed
Hale Waihona Puke 、实验用品• 1．器材– 离心机、研钵或组织捣碎机、显微镜、天平、 离心管、纱布、烧杯、量筒、滴管、载玻片、 盖玻片
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。