GFP融合蛋白引物设计实例

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达(新手详细注释版)

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子。

发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。

1996 年 GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。

该法用于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。

二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到200kb 。

质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

在大多数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制10-200 个拷贝。

当宿主细胞的蛋白时所用的酶是相同的。

有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳物创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI 和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

GFP融合蛋白进行蛋白质的亚细胞定位

? 2008年诺贝尔化学奖 ? GFP的结构特点 ? GFP的发光机理 ? GFP的荧光特性 ? GFP的优点 ? GFP的改进 ? GFP的应用
日裔美国科学家下村修美国科学家马丁·查尔非美国华诺裔贝科尔奖学委家员会钱将永化健学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁·沙
尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。
GFP及其主要突变体的荧光特征 nm
项目
激发峰
野生型（wt-GFP）红移突变体RSGFP 黄绿突变体YGFP
蓝色突变体BFP 增强型突变体OGFP 半衰期短的突变体
395 471-490
513 385 385 488
发射峰 509
502-511 527 445 510 507
? 易于检测 ? 荧光稳定 ? 无毒害 ? 通用性 ? 易于构建载体 ? 可进行活细胞定时定位观察 ? 易于得到突变体
? 一条α螺旋缠绕在圆柱体的轴位置
? 生色团附着在α螺旋上，几乎完美地包埋于圆柱体中心
? 这种方式被称为β罐 (β-can)
GFP的生色团是GFP发出荧光的物质基础。
实质：由第65、66、67位的丝氨酸—脱水酪氨酸—甘氨酸
形成对羟苯甲基咪唑环酮
? GFP的最大吸收峰为 395nm(紫外)，并有一个 479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为 509nm(绿光)
? 译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白质在胞内定位。
? 蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。理解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。
蛋白质的亚细胞定位常用方法：

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化崔小进;杨帆;戴有金;李章富;吕永通;胡风庆【摘要】构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白.通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定.经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在1PTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白.成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础.%The expression vector of delta sleep inducing peptide ( DSIP) and fusion gene of GFP to highly efficiently express and purify CFP-DSIP fusion protein was constructed. The whole length encoding gene of DSIP was joined through SOE-PCR and made the upstream of DSIP possessing an enterokinase recognition site and directionally cloned into an expression vector pET-28a by double enzyme digestion to construct a recombinant expression vector pET-28a-DSIP. The whole length of CFP encoding gene was amplified with PCR, and directionally cloned into pET-28a-DSIP by double enzyme digestion to construct procaryotic recombinant expression vector of pET-28a-GFP-DS!P. After double enzyme digestion and sequence testidentification it was induced into host strain E. Coli BL21; and IPTC induced expressed the fusion protein. And obtained high purity protein adopting Ni-NTA affinity chromatography and molecular sieve gel chromatography, and then analyzed and identified by SDS-PAGE. The results showed that the procaryotic expression vector of pET-28a-GFP-DSIP was successfully constructed identified by sequencing; under the induction of IPTG obtained a fusion protein of soluble green fluorescent protein and sleep inducing peptide. And successfully obtained high purity fusion protein adopting Ni-NTA affinity chromatography purification. The recombinant prokaryotic expression vector of fusion gene of DSIP and GFP was successfully constructed, the optimal conditions for induced expression of GFP-DSIP fusion protein was confirmed, and obtained fairly high purity fusion protein. It laid a foundation for further studies on the biological function of DSIP protein.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2012(032)001【总页数】4页(P33-36)【关键词】δ-睡眠肽(DSIP);基因克隆;融合蛋白;原核表达【作者】崔小进;杨帆;戴有金;李章富;吕永通;胡风庆【作者单位】辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室,辽宁沈阳110036;辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室,辽宁沈阳110036;辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室,辽宁沈阳110036;辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室,辽宁沈阳110036;辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室,辽宁沈阳110036;辽宁大学生命科学院生物材料与生物制药实验室,辽宁沈阳110036【正文语种】中文【中图分类】Q78Delta-睡眠肽(Delta sleep inducing peptide，DSIP)是一种存在于动物体内的促睡眠物质，由Monnier等［1］于1963年从被微电流刺激的家兔脑静脉血通过体外血液透析等方法分离得到。

蛋白A_绿色荧光蛋白融合蛋白的构建与表达

作者简介:赵志晶,女,博士研究生1联系作者2　parasiticus when in the prescence of Streptococcus lactis .M ycopathologia ,1981,73:49—562　EI G endy S M ,M arth EH.G rowth and aflatoxin production by Aspergillusparasiticus when in the prescence of Lactobacillus casei .J F ood Prot ,1981,44:211—2123　K arunaratne A ,W ezenberg E ,Bullerman LB.Inhibition of m old growthand aflatoxin production by Lactobacillus spp .J F ood Prot ,1990,53:230—2364　Hassan G,Bullerman LB.Inhibition of growth and aflatoxin production ofAspergillus flavus by Lactobacillus spp .J F ood Prot ,1995,58:1249—12565　Hassan G,Bullerman LB.Antimycotic and antiaflatoxigenic effect of Lactic acid bacteria :A Review.J F ood Prot ,1995,58:1275—12806　E l G azzar FE ,Rusul G,M arth EH.G rowth and aflatoxins production byAspergillus parasiticus NRR L 2999in the presence of lactic acid and atdifferent initial pH values.J F ood Prot ,1987,50:940—9447　E lNezam i H ,K ankaanpaa P ,Salm inen S ,et al.Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind food carcinogens.F ood Chem T oxicol ,1998,36:321—3268　E lNezam i H ,M ykkaanpaa P ,K ankaanpaa P ,et al.Ability of Lactoba 2cillus and propionibacterium strains to rem ove aflatoxin B ,from the chick 2en duodenum.J F ood Prot ,2000,63:549—552(2001203205收稿)第31卷　第1期2002年　2月卫　生　研　究JOURNA L OF HYGIE NE RESE ARCH V ol.31　N o.1Feb.　2002　49文章编号:100028020(2002)0120049204・论著・蛋白A 2绿色荧光蛋白融合蛋白的构建与表达赵志晶　刘秀梅1中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所,北京　100050摘要:绿色荧光蛋白(G FP )是一种生物发光蛋白。

待测蛋白与gfp蛋白的融合表达

待测蛋白与gfp蛋白的融合表达待测蛋白与GFP蛋白的融合表达是一项常用的实验技术，可以用来研究蛋白的亚细胞定位、功能性研究以及蛋白的相互作用等。

在本文中，我将以一步一步的方式解释待测蛋白与GFP蛋白的融合表达的过程和原理。

第一步：选择适合的表达载体在进行待测蛋白与GFP蛋白的融合表达之前，首先需要选择合适的表达载体。

常见的表达载体包括质粒和病毒载体。

质粒通常用于体内表达，病毒载体则可以用于体内或体外表达。

选择表达载体时，需要考虑载体的大小、复制起源、选择标记等因素。

在此过程中，一个常用的表达载体是pEGFP-C1，它兼具了高效的GFP蛋白表达和稳定性。

第二步：将待测蛋白与GFP基因连接在将待测蛋白与GFP蛋白融合表达之前，需要将待测蛋白基因与GFP基因连接。

连接的方法有多种，常见的方法包括PCR扩增和限制性内切酶消化连接。

PCR扩增可以利用引物特异性扩增待测蛋白基因和GFP基因的DNA片段，然后通过连接酶将两个PCR产物连接在一起。

限制性内切酶消化连接则需要选择适合的限制性内切酶将待测蛋白基因和GFP基因进行消化，然后通过DNA连接酶将两个消化片段连接在一起。

第三步：转染细胞或注射在融合表达载体构建完成后，下一步是将表达载体导入到细胞中。

有两种常见的方法可以实现这一步骤：细胞转染和动物体内注射。

细胞转染可以通过化学法、电穿孔法或基因枪等技术将表达载体导入到细胞中。

动物体内注射则可以将表达载体注射到实验动物体内，使表达载体进入目标组织或器官。

第四步：蛋白表达检测一旦表达载体成功转染或注射到细胞或动物体内，下一步是检测蛋白的表达情况。

常见的方法包括免疫荧光染色、免疫组织化学、Western blot 等。

免疫荧光染色可以使用抗GFP抗体或待测蛋白特异性抗体与GFP融合蛋白结合，并通过荧光显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位。

免疫组织化学可以利用特异性抗体与融合蛋白结合，并使用组织化学染色技术观察蛋白的分布情况。

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。

本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。

关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。

2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。

3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。

4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。

5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。

7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。

绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达

绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。

所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。

将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。

关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。

1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。

长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。

1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。

GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。

基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。

GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。

本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。

其上有所用酶的酶切位点。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达

分子生物学综合实验论文题目: 绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达中国·黄石2010年12月绿色荧光蛋白（GFP）基因的克隆与表达胡丽丹（湖北师范学院生命科学院0803班湖北黄石 43500）摘要：绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

用碱裂解法提取的的质粒pEGFP-N3和pET-28α经过Bam H I和Not I双酶切连接后，得到pET-28α-pEGFP-N3重组质粒。

取部分的重组质粒做酶切实验，验证重组质粒的存在性，剩下的重组质粒导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中。

重组有GFP基因的E. coLi BL-21，在含有1 μL/mL 的卡纳霉素的LB培养基上培养。

当A600达到0.7时，用终浓度为0.8 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时，离心得到下层绿蓝色沉淀物即可。

关键词：绿色荧光蛋白 GFP 基因的克隆荧光蛋白水母CLoning and Expression of Green FLuorescent Protein GeneHU Li-Dan( Class three Grade eight, College of Life Sciences department,Hubei Normal university ,Huangshi 435000)Abstract：Green fluorescent protein（GFP）,one kind of bioluminenscent proteins ,hasbeen found existing in the internal of Coelenterates,such as fellyfish,polyp and coral pEGFP-N3 and pET-28αwas harvested by sodium dodecylsulfate(SDS) alkaline process extraction and Agarose Gel Electrophoresis.After treating the two targeted plasmids with Bam H I and Not I, the recombinant plasmid,namely pET-28α-pEGFP-N3, can be retrieved by furthermore Agarose Gel Electrophoresis. Taking slight recombinant plasmid proves that recombinant plasmid does exist by dienzyme cutting(Bam H I and Not I).The recombinant plasmid lefting would be transported to E. coLi BL-21the competent cells. E. coLi BL-21containing recombinant GFP gene was grown overnight in LB solid medium containing kanamycin (Final concentration: 1 μL/mL). When absorbance at 600 nm value was 0.7, isopropyL β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.8 mM and the incubation was continued an addition 3 h.Key words:Green fluorescent protein Fellyfish Genetic Cloning Fluorescin目录1.前言： (1)1.1绿色荧光蛋白（GREEN FLUORESCENT PROTEIN，GFP） (1)1.1.1 GFP研究背景 (1)1.1.2 GFP研究应用 (2)1.2基因的克隆与表达 (3)2.实验试剂及实验仪器： (5)2.1实验试剂与材料： (6)2.2实验仪器： (7)3.实验方法 (7)3.1质粒提取方法: (7)3.2琼脂糖凝胶电泳及回收: (9)3.3酶切及连接： (11)3.4E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入： (12)3.5酶切验证重组质粒： (13)3.6GFP基因的表达 (14)3.6.1活化菌种 (14)3.6.2扩大培养 (14)3.6.3 IPTG诱导GFP基因的表达 (14)4.结果与分析 (14)4.1质粒提取过程中现象与结果： (14)4.2琼脂糖凝胶电泳 (15)4.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入结果： (16)4.4酶切验证重组质粒 (16)4.5GFP基因的表达结果： (17)5.讨论： (18)5.1提取质粒出现图六的原因是： (18)5.2琼脂糖凝胶电泳出现图七、图八原因： (18)5.3E. CO L I DH5Α或E. CO L I BL21感受态制备及转入出现图九、十原因: .. 19 5.4酶切验证重组质粒出现图十一原因： (19)5.5GFP基因的表达结果如图十二、十三原因： (19)6.参考文献 (20)前言：1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）1.1.1 GFP 研究背景绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

GFP 与微管结合蛋白和肌动蛋白结合区融合蛋白载体构建与表达

图2植物表达载体pact1gfp2map4bd的构建过程融合基因的瞬间表达上述构建完成的pact1gfptalinpact1gfp2map4bd两质粒利用基因枪导入洋葱表皮细胞经过16h的短时间培养观察到融合基因的正常表达结果分别见图3以往研究植物细胞骨架通常是采用化学染料标记的方法即将荧光标记蛋白如罗丹明微管蛋显微注射到细胞然后用荧光或共聚焦显微镜对其进行监测这样就可以观测到植物细胞皮层和纺锤体微管细胞骨架的动态行为
3
讨
论
以往研究植物细胞骨架通常是采用化学染料标记的方法 , 即将荧光标记蛋白( 如罗丹明微管蛋白) 显微注射到细胞 , 然后用荧光或共聚焦显微镜对其进行监测, 这样就可以观测到植物细胞皮层和纺锤体微管细胞骨架的动态行为。肌动蛋白细胞骨架的研究也采用了相似的方法。但是要将标记蛋白注射到细胞内部 , 尤其是具有细胞壁的植物细胞, 需要较长的操作时间 , 并有一定的技术要求 , 而且只适于分离或暴露的单细胞。另外, 显微注射对细胞本身来说是一种侵害性行为, 会干扰细胞正常的功能。而应用 GFP 在很大程度上可以克服以上缺点和局限性。Marc 等
图 2 植物表达载体 pAct1 GFP2 MAP4BD 的构建过程
2 3
融合基因的瞬间表达上述构建完成的 pAct1 GFPTALIN 和 pAct1
4 的微管结合区融合后转化植物, 通过融合蛋白在植物细胞的瞬时表达对表皮细胞的皮层微管进行
GFP2 MAP4BD 两质粒 , 利用基因枪导入洋葱表皮细胞, 经过 16h 的短时间培养 , 观察到融合基因的正常表达 , 结果分别见图 3 和图 4。
特定的限制性内切酶作完全或部分酶切 , 通过多步骤的酶切、连接、转化等过程, 构建完成 2 个可通过农杆菌介导转化的植物表达载体。分别命名为 : pAct l GFPTALIN 和 pActl GFP2 MAP4BD。在洋葱表皮细胞中的瞬间表达结果显示, 两个载体均可正常工作。关键词载体构建 GFP 发育运输等研究中。水稻为重要的粮食作物和禾本科遗传研究的模式实验材料。其雄性不育系在水稻杂种优势的利用中起决定性作用。研究表明, 雄性不育系花粉败育与小孢子发生过程中微管和微丝蛋白的行为异常有关

绿色荧光蛋白（gfp）标记亚细胞定位[整理版]

绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位一、原理利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。

利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，在光镜水平进行研究，不需要制样，没有非特异性标记的影响。

并且GFP的分子量为27kD，经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位。

激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。

二、主要步骤1．真核表达载体的构建①引物设计利用引物设计软件，根据pEGFP-N1的酶切位点设计目的基因引物：②载体构建将PCR产物酶切后插入pEGFP-N1，得到表达目的基因与EGFP融合蛋白质的真核表达载体。

2．转染真核细胞当细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。

当细胞贴壁率达到30%~50%时，将表达载体质粒2ug和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml分别溶于100 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基中，充分混匀后，室温放置15 min，再将两种溶液充分混匀，室温放置30 min。

同时用无血清、无抗生素的DMEM洗涤待转染的培养细胞2~3次，向DNA-脂质体混合物中加入800 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基，混合后加入到培养细胞中。

培养皿放入37℃孵箱孵育6~8 hr后吸去双无培养液，加入2~3 ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培养基，继续培养24~72 hr。

4．激光扫描共聚焦显微镜观察将上述细胞分别在24、、36、48、72小时用共焦显微镜观察，采用激光扫描共聚焦显微镜，激发波长为488nm，采取图像。

-自制绿色荧光蛋白_GFP_的血清抗体

-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆丁推荐↓精品文档The Best Literature----------------------------------The Best Literature50生物学通报2009年第44卷第8期绿色荧光蛋白（GFP）在蓝紫光的激发下可以发射绿色荧光，很容易追踪，经常被做成融合蛋白，广泛用于细胞生物学与分子生物学研究中。

与此相联系，GFP的抗体也被广泛应用。

因为GFP 抗体售价昂贵，为本科学生开设的大实验使用商品化的GFP抗体是不现实的，但完全可以自己动手来制备GFP的血清抗体。

制备抗体最关键的就是要得到足够量和足够纯的抗原。

虽然纯的GFP可以很方便地买到，但与其抗体一样价格不菲。

其实GFP可以很容易自己制备，因为它会发绿色荧光，自身就带标记，甚至连标准的样品都可以没有，便可以准确无误地加以辨认。

笔者用表达GFP的大肠杆菌超声破碎后的离心上清，无须过柱等繁琐步骤，只需简单地进行非变性条件聚丙烯酰胺凝胶电泳一步，就可以分离纯化足够量的GFP，用于动物的免疫。

下面就介绍一下这个方法。

1抗原的制备1．1所需的主要材料1）pGLO质粒(BIO-RAD公司）;2）超声波组织细胞破碎仪;3）紫光灯（BIO-RAD 公司，可用简易小验钞灯代替）；4）垂直板电泳槽。

1．2大肠杆菌的培养和诱导从Amp/LB琼脂板上培养的pGLO/HB101大肠杆菌中挑取2～3个菌落，接种于含氨苄青霉素（终浓度100μg/mL）5mL LB的试管中，于恒温摇床中37℃培养过夜。

将5mL的培养物全部转移到装有400mL LB的三角瓶中，加入氨苄青霉素（终浓度100μg/mL），恒温摇床上37℃振荡培养8~12h后，加入L-阿拉伯糖干粉（终浓度1mg/mL），37℃继续振荡培养24h，注意要通气良好。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取之欧阳引擎创编

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳引擎（2021.01.01）南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)9 5.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASE-FREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液13 9．PEGFP-N3质粒全图谱1310．P ET-28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

GFP在蛋白质相互作用研究中的应用

1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。

研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。

它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。

酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。

来源于水母的GFP在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。

科学家利用两个增强型GFP（EGFP）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。

该系统在基因水平上将EGFP片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。

与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。

在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP能够重新结合而发出荧光(图7)1.1 构建分离的EGFP报告质粒以分离的EGFP作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。

从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。

EGFP报告质粒包括pNEGFP和pCEGFP。

构建模式见图8。

在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被ADH1终止子序列终止。

构建的EGFP报告质粒pNEGFP和pCEGFP分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝数起始位点（CEN6/ARS4起始位点）的着丝粒质粒。

这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了酵母细胞中的蛋白毒性问题。

GFP融合蛋白引物设计实例

引物设计实例分析
引物设计基本原则
引物长度（primer length）
产物长度（product length）
序列Tm值(melting temperature)
G+C含量（composition）
引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）
阅读框
1. 引物的长度
一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。

2.产物的长度
扩增片段长度为100~600碱基对.
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.
Tm=2(A+T)+4(C+G)
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物自身
引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
任务：
用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
引物要求
PCR扩增GFP
GFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变
第一步：扩增GFP基本序列
第二步：GC比值；Tm值第三步：酶切位点
第四步：阅读框
第五步保护序列
Primer1: 5’ GCGGggatccTA TGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC。

基因操作与技术EGFP蛋白质的克隆表达

南咳諾实验报告基因分析和操作原理题目EGFP蛋白质的克隆表达学号姓名：___________学院： ________ 生命科学学院专业：______________ 生命基地________ 班级： ________ 生命基地91班2012年6月6日一、实验目的学习目的基因片段的PCR及其产物回收的原理与方法。

学习目的基因的双酶切、与载体的连接及其转化的原理与方法。

重组子的鉴定及筛选的原理与方法。

二、实验原理EGFP简介：En ha need Green Fluoresce nt Protein 增强绿色荧光蛋白,EGFP 是GFP 突变系目前应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白（E G F P ）（ 6 4 位苯丙一亮），发射出的荧光强度比G FP大6倍以上，因此，比G FP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等绿色荧光蛋白（GreenFluorescent Protein,简称GFP）是一种在美国西北海岸所盛产的水母中所发现的一种蛋白质。

这类学名为Aequorea victoria的水母有着美丽的外表，生存历史超过1.6亿年。

1962年，下村修正是在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。

它之所以能够发光，是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸（丝氨酸一酪氨酸一甘氨酸）残基，可自发地形成一种荧光发色团。

发光机理当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以亲密接触”导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。

但此时还不能发射荧光，只有当有分子氧存在的条件下，发生氧化脱氢，方能导致绿色荧光蛋白发色团的成熟”形成可发射荧光的形式。

上述绿色荧光蛋白发色团的形成过程，系由几位科学家分别研究完成的。

绿色荧光蛋白分子绿色荧光蛋白不仅无毒，而且不需要借助其他辅酶，自身就能发光，可以让科学家在分子水平上研究活细胞的动态过程。

当绿色荧光蛋白的基因和我们感兴趣的有机体内所拟研究的蛋白质基因相融合时，蛋白质既能保持其原有的活性，绿色荧光蛋白的发光能力也不受影响。

gfp融合基因 -回复

gfp融合基因-回复什么是gfp融合基因？GFP融合基因是一种常用的研究生物学领域的技术手段，它能够将报告基因gfp（绿色荧光蛋白）与感兴趣的基因相连，从而使得该基因在生物体内表达时可以产生绿色荧光。

这种技术的应用广泛，可以用于研究基因的转录、翻译和定位等。

下面将对gfp融合基因的制备和应用过程进行详细解析。

一、gfp融合基因构建1. 选择合适的载体：在构建gfp融合基因时，首先需要选择一个合适的载体，通常可以选择常用的质粒载体，如pEGFP-C1或pEGFP-N1等。

这些载体具有高效的转染和表达能力，适用于多种生物体系。

2. 制备模板：接下来，需要制备感兴趣的基因的DNA模板。

可以通过PCR扩增、酶切片段或合成DNA片段的方式获得。

3. 进行连接：将gfp和基因片段按照设计的连接方式进行连接。

一般情况下，可以利用同源重组或PCR扩增的方法进行连接。

连接时需要注意选择正确的连接位点，避免破坏gfp和基因的功能。

4. 进行双酶切：将连接产物进行双酶切，以验证连接是否成功。

双酶切时需要选择合适的限制酶，将连接产物切割为预期大小的特异性片段。

5. 克隆验证：将切割后的连接产物进行电泳分析，验证连接的正确性。

当连接成功时，连接产物将会产生与预期大小相符的片段。

6. 测序验证：为了进一步确认gfp融合基因的正确性，可以将连接产物进行测序验证。

通过测序，可以得到gfp和基因的序列信息，确保其与设计一致。

二、gfp融合基因的应用1. 转染：将gfp融合基因导入到感兴趣的生物体系中，通常采用转染的方式。

可以选择适合该生物体系的转染方法，如病毒转染、化学转染或电穿孔等。

2. 表达检测：通过检测绿色荧光的表达情况，可以判断gfp融合基因是否被成功表达。

可以通过荧光显微镜观察，或者进行流式细胞仪等技术的检测。

3. 研究基因功能：通过诱导gfp融合基因的表达，可以研究其在生物体内的功能。

例如，可以观察该基因的转录和翻译过程，或者通过定位研究其在细胞中的分布情况。

gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001 姓名：刘会淼2013 年3 月13实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein ，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。

实验方法; 通过分别将DH-5α(pEGFP-N3) 和DH-5 α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入 E.coli DH-5 α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I 与Bam H1 和PCR 对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21 内进行表达，再用IPTG 诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP 基因在大肠杆菌中成功表达。

1. 材料与方法：1.1.1 实验材料克隆菌E.coli DH-5a 、表达菌BL-21 为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3 ，引物，限制性内切酶Bam H1 、Not Ⅰ1.1.2仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH 计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管1.1.3试剂及溶液分装后于121 ℃高压灭菌20 min 。

（LB 固体培养基是在液体LB 中加琼脂粉至 1 %）；溶液Ⅰ50 mL葡萄糖50 mmol/LTris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/LEDTA (pH 8.0) 10 mmol/L121℃高压灭菌15 min 后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ100 mLNaOH 0.2 mol/LSDS 1% (W/V)用时由母液 2 mol/L NaOH 、10%(W/V) SDS 稀释现配；溶液Ⅲ100 mLKOAc (5 mol/L) 60 mL冰乙酸11.5 mLH2O 28.5 mL121 ℃高压灭菌15 min后置于0~4 ℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA 聚合酶；TaqDNA 聚合酶缓冲。

GFP融合蛋白

GFP融合蛋白GFP（绿色荧光蛋白）是从水母体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成。

实验室中常用的重组GFP标签更接近水母的GFP，其分子量为27kD左右。

GFP本身是一种酸性、球状、可溶性天然荧光蛋白。

按一定规则，11条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏；α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。

图1：GFP的结构图示GFP的发光机理物质基础：GFP的生色团•由65~67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸（Ser-Tyr–Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮，形成生色团。

•GFP发出荧光稳定，无需再添加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光。

在450~490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上。

适合于活体检测，在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强。

•GFP生色团的形成没有物种特异性，可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。

•发色团上的共轭π键能吸收激发光能量，在很短的时间后，以波长更长的发射光释放能量，形成荧光。

例：GFP在水母中能发光，是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。

水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。

这是物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。

GFP的荧光特性•GFP的最大吸收峰为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm 的副峰（蓝光）；发射光谱最大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰。

•GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐（FITC）相似，所以GFP 观察可用荧光显微镜滤光片组合。

•GFP需在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式。

GFP的优缺点及改进方法GFP的优点•易于检测，灵敏度高；•荧光稳定；•对细胞无毒害作用；•广谱通用性；•易于构建载体；•可进行活细胞实时定位观察；•易于得到突变体；•不受假阳性干扰。

GFP的缺点尽管GFP作为分子探针具有多种优点，但野生型GFP仍具有一定缺点：•GFP有两个激发峰影响特异性，且长波激发峰强度较小，不易观察；•GFP合成及折叠产生荧光的过程慢，蛋白质折叠受温度影响大，表达量较低；•GFP在某些植物细胞中不表达。