抗菌药物联合应用缩小细菌耐药突变选择窗的研究

（３）Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ。・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・’３４
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ…………・……………・………・………………………………………………・３６
＞３２，＞３２，１６，１６；
ＭＥｆｌ、ＣＡＺ、ＡＭＫ、ＣＩＰ与利血平联合后Ｓ１分别为１６、１６、
１６、８；与奥美拉唑联合后分别为１６、３２、１６、８；与阿奇霉素联合后分别为８、
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１６、１６、８；与ＣＣＣＰ联合后分别为８、８、１６、８；与ＰＡ Ｂ Ｎ联合后分别为８、１６、 １６、８。ＭＥＭ、ＣＡＺ、ＣＩＰ分别与ＡＭＫ联合后的Ｓ１分别为４、４、８。阿米卡星与环 丙沙星联合后阿米卡星的ＳＩ为４。 ３动物实验： ３．１单用环丙沙星组：ＩＭＩＣ、２ＭＩＣ、４ＭＩＣ、８ＭＩＣ组家兔组织液中均有耐药突变 体的生长，随浓度提高，菌落数逐渐减少，１６ＭＩＣ组没有耐药突变体生长。 ３．２环丙沙星联合妥布霉素组：环丙沙星浓度为ＩＭＩＣ、２ＭＩＣ组有耐药突变体生 长，４ＭＩＣ、８ＭＩＣ、１６ＭＩＣ组没有耐药突变体的生长。 结论 体外体内试验证实，两种抗菌药物联合应用可以缩小细菌药耐药突变选 择窗，减少耐药突变体产生的机会，从而有效控制细菌耐药。抗菌药物与外排抑 制剂联合可以缩小突变选择窗，但作用弱于两种抗菌药物联合，从而推测突变选 择窗内富集扩增的耐药菌，在高于ＭＩＣ浓度的抗菌药物压力下，主动外排系统只 有少量激活，也没有新的外排系统的产生。
ＭＵＴＡＮＴ
ＳＥＬＥＣＴＩｏＮ
ＷＩＮＤｏＷＳ
ＡＮＴＩＢＡＣＴＥＩＵＡＬ ＡＧＥＮＴＳ ＡＧＡＩＮＳＴ
ＢＡＣＴＥＲＩＵＭ
作 专 导
者
业
塞Ｉ踢洼 内科堂（哩吸丕痘≥一
师
奎垂教授
合作导师
２０１
０年５月１ ３日
原创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。
第二部分：耐药机制初步分析 （１）材料和方法………………………………………………………………………・２４ （２）结 （３）讨 果…………………………………………………………………………・２５ 论…………………………………………………………………………・２６
第三部分：动物实验 （１）材料和方法………………………………………………………………………・２９ （２）结 （３）讨 结 果…………………………………………………………………………。３３ 论…………………………………………………………………………＋３４ 论………………………………………………………………………………………………………”３６
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ・・・・・・・・……・…・・・・・・・・・・・・・・…・・…・・・・…・・・…・…・・・・・…・・・・・・・…・・・・・・……・・…・・３７
Ｒｅｖｉｅｗ…・…・・・・・・・……・・・・・・・・・・・・・・・・・・…・・・・・・・・…・・・－…・……・・・・・・・・・・・・・－・…・・・・・・・…・…・・４０
论文作者签名：量也旦盘导师签名： 秀弓
日期：坐／弓
山东大学硕士学位论文
目
录
中文摘要………………………………………………………………………………・７ 英文摘要……………………：ｊ．………………………………………………………一１
１
符号说明………………………………………………………………………………１５ 前‘言………………………………………………………………………………………………………”。１６ 翮 吾………………………………………………………………………………………………………”Ｏ 第一部分：体外实验 （１）材料和方法………………………………………………………………………‘ｌ ８ （２）结 （３）讨 果…………………………………………………………………………‘２０ 论…………………………………………………………………………・２１
Ｐｒｅｆａｃｅ………………………………………………………………………………………・１６
Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｏｎｅ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｔｅｓｔ
（１）Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ……………………………………………………………・１ ８
（２）Ｒｅｓｕｌｔ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・－・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・２０
分类号：Ｒ９７８
密 级：
单位代码：１０４２２
学 号：２００７１２７７７
◎∥萎只孥
硕士学位论文
Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ’Ｓ Ｔｈｅｓｉｓ
论文题目：抗菌药物联合应用缩小细菌 耐药突变选择窗的研究
ＪＯＩＮＴ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ｏＦ ＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣＳ ＲＥＤＵＣＥ ＯＦ ＴＨＥ
（ＣＩＰ一４：ＣＡＺ－８）；ＡＭＫ＋ＣＡＺ（ＡＭＫ一８：ＣＡＺ一４）。
１．２金黄色葡萄球菌：万古霉素对金黄色葡萄球菌ＡＴＣＣ２９２１３的ＭＩＣ、ＭＰＣ以及 Ｓ１分别为１．０ ｐ ｇ／ｍＬ、５１．２
ｕ
ｇ／ｍＬ、５１．２，万古霉素分别联合利福霉素与左氧
ｕ
氟沙星后的ＭＰＣ及Ｓ１分别为１２．８
ｇ／ｍＬ、２５．６；８．０
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色葡萄球菌的ＭＩＣ与ＭＰＣ，同时应用棋盘格法和琼脂平板稀释法测定联合左氧氟 沙星与利福霉素后万古霉素的ＭＩＣ与ＭＰＣ，并计算选择指数ＳＩ，观察能否缩小突 变选择窗。 １．３大肠埃希菌：选择环丙沙星（ＣＩＰ）与阿米卡星（ＡＭＫ）为试验药物，分别应 用琼脂平板稀释法和棋盘格法测定单独以及联合之后的ＭＩＣ，琼脂平板稀释法测 定单独及联合时对大肠埃希菌的防耐药突变浓度ＭＰＣ，并计算相应的选择指数 ＳＩ，观察能否缩小突变选择窗。 ２．耐药机制的初步分析：选择铜绿假单胞菌为代表，观察主动外排系统在突变 选择窗内细菌耐药所起的作用。
论文作者签名：墨Ｉ！目盔
日
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目
的 在体外和动物体内探讨抗菌药物的联合应用能否缩小细菌对单药的耐药突
变选择窗，能否有效控制细菌耐药。同时观察突变选择窗内细菌的耐药机制。 方法 １．体外试验：选择铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌三种细菌的标 准菌株进行试验。 １．１铜绿假单胞茵：选择头孢他啶（ＣＡＺ）、阿米卡星（ＡＭＩ（）和环丙沙星（ＣＩＰ） 为试验药物，分别应用琼脂平板稀释法和棋盘格法测定单药以及两两联合联合之 后的ＭＩＣ。琼脂平板稀释法测定单药及两两联合时对铜绿假单胞菌的防耐药突变 浓度ＭＰＣ，并计算选择指数ＳＩ（ＭＰＣ／ＭＩＣ），观察能否缩小突变选择窗。 １．２金黄色葡萄球菌：分别应用Ｅ－ｔｅｓｔ与琼脂平板稀释法测定万古霉素对金黄
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ＣＡＴＡＩ。ＯＵＥ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｂｓｔｒａｃｔ……………………………………………………………………………７
Ｅｎｇｌｉｓｈ Ａｂｓｔｒａｃｔ…………………・……・………………・………………………………・・１ １
Ｓｙｍｂｏｌｉｃ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ。…・・…・・・・・・・・…・・・・…・・・・・・・…・・・・・・・・・・・…・・・・・・…・・・・・・……・・・・・１５
参考文献………………………………………………………………………………３７ 综 述………………………………………………………………………………………………………．．４０
３
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致
谢………………………………………………………………………………４８
攻读学位期间发表的论文……………………………………………………………４９
２．１
Ｅ－ｔｅｓｔ测定美罗培南（ＭＥＭ）、头孢他啶（ＣＡＺ）、阿米卡星（ＡＭＫ）、环丙沙星
（ＣＩＰ）四种抗铜绿假单胞菌药物单药ＭＩＣ。 ２．２棋盘格法测定联合利血平、奥美拉唑、阿奇霉素、ＣＣＣＰ、ＰＡ Ｂ Ｎ五种外排抑 制剂后抗菌药物对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度ＭＩＣ。 ２．３琼脂平板二倍稀释法测定抗菌药物单药以及联合外排抑制剂后防耐药突变 浓度（ＭＰＣ），并计算相应的选择指数ＳＩ。同时用美罗培南、头孢他啶、环丙沙 星分别联合阿米卡星，阿米卡星联合环丙沙星，分别测定联合前后的ＳＩ，比较 联合抗菌药物与联合外排抑制剂在防铜绿假单胞菌耐药突变的能力，分析主动外 排系统在突变选择窗内细菌耐药所起的作用。 ３．动物实验：在家兔体内观察环丙沙星联合妥布霉素后，能否降低环丙沙星对 铜绿假单胞菌的防耐药突变浓度，控制细菌耐药。 ３．１建立兔组织笼感染模型 ３．２高效液相色谱法测定环丙沙星在兔组织液中药代动力学参数
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抗菌药物联合应用缩小细菌耐药突变选择窗的研究 研究生：刘明涛 导师：李玉教授 中
背景 细菌耐药是一个极为复杂的问题，应该从多个方面给与重视，其中临床上给 药剂量的不规范是导致细菌耐药的一个重要因素。１９９９年突变选择窗理论的提 出恰恰解决了这一问题，该理论认为：耐药突变体亚群在应用抗菌药物治疗之前 已经存在，而在应用抗菌药物治疗时，如果抗菌药物的浓度位于突变选择窗
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３．３试验分组：５５只家兔随机分为１１组，１组为生理盐水组最为对照，５个组 为单用环丙沙星，其余５个组为环丙沙星联合妥布霉素，每组５只家兔。每只均 注入１０１０ｃｆｕ／ｍｌ浓度的铜绿假单胞菌ＡＴＣＣ２７８５３
ｉｍｌ，
３．４给药方案：环丙沙星按照药代动力学参数设计给药方案，一天内ｌＯ次给药， 每次给药间隔２小时，使单药组与联合组家兔血环丙沙星稳态浓度分别均达到 ＩＭＩＣ、２ＭＩＣ、４ＭＩＣ、８ＭＩＣ、１６ＭＩＣ浓度，联合组妥布霉素给药方案参照参考文献， 是其稳态浓度均达到其２－４ＭＩＣ浓度，治疗三天，抽取组织液，稀释后涂布琼脂 平板，观察耐药突变体生长情况。 结果： １体外实验： １．１铜绿假单胞菌：ＣＩＰ、ＡＭＫ、ＣＡＺ单药对铜绿假单胞菌的Ｓ１分别为１６、１６、 ＞３２。两两联合后各自单药的Ｓ１分别为：ＣＩＰ＋ＡＭＫ（ＣＩＰ－８：ＡＭＫ一４）：ＣＩＰ＋ＣＡＺ
Ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｅｍｅｎｔ’・・・・・・・・－・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・５５
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ａｒｔｉｃｌｅｓ・…・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…・・・・・・・・・…・・・・・・…・・・・・……・・・・・・・・……・・・５６
（３）Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ……………………………………………………………………………．．２１
Ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｔｗｏ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
（１）Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ……………………………………………………………・２４
（２）Ｒｅｓｕｌｔ……………………………………………………………………………………２５
（３）Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ……………………………………………………………………………．．２６
Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｔｈｒｅｅ．Ａｎｉｍａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
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（１）Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ……………………………………………………………・２９
（２）Ｒｅｓｕｌｔ……………………………………………………………………………………３３
ｕ
ｇ／ｍｒ、１６．０。
１．３大肠埃希菌：ＣＩＰ、ＡＭＥ单药对大肠埃希菌的Ｓ１分别为１６和３２。两者联合 应用时，当ＡＭＫ浓度达到２ＭＩＣ、ＣＩＰ达到其２ＭＩＣ时便可抑制耐药突变体产生。 联合后的Ｓ１分别为８（０．００８／０．００１）和８（２／０．２５）。 ２耐药机制的初步分析：ＭＥＭ、ＣＡＺ、ＡＭＫ、ＣＩＰ四种抗菌药物单药的Ｓ１分别为
（ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ
文
摘
要
ｗｉｎｄｏｗ，ＭＳＷ）之间，耐药突变体会选择性富增，ＭＳＷ的上
ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
界值为防耐药突变浓度（ｍｕｔａｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＰＣ）。因此，关闭或者
缩小ＭＳＷ可以较少细菌发生耐药突变的机会。当两种不同作用机制的抗菌药物 联合应用，并同时处于各自的ＭＩＣ之上时，细菌需要同时发生两种耐药突变才能 生长从而关闭ＭＳＷ，从而有效控制细菌耐药。