2种染色方法在微核试验中的比较

游猎性等特点 ， 是农作物害虫的主要捕食性天敌（ 李锐等 ，０ ７。 ２０ ） 近年来人们对蜘蛛的研究有所加深 ， 但对星豹蛛的 Ｄ Ａ损伤的研究较少 。 Ｎ Ｎ Ｄ Ａ作为生命活动中最 重要的遗传物质 ， 在维护机体的正常功能上有举足轻重的作用。 由于 Ｄ Ａ结构特点及半保 留复制特性 ， Ｎ Ｄ Ａ分子易出现损伤 ， Ｎ 引起细胞及机体损害。 Ｄ Ａ损伤 的修复， 对 Ｎ 则是机体抵御各种伤害的基础。 当细 胞中 Ｄ Ａ受到损伤时， Ｎ 会威胁基因组的完整性 ， 对于这些损伤 ， 由于 Ｄ Ａ结构微小 ， Ｎ 直接检测过于复杂 和困难 （ 斌等 ，ｏ２ 。 吕 ２ｏ） 微核 （ ｃ ｎｃ ｉ简称 （ Ｎ） Ｍｉ ｏ ｕｌ ） ｒ ｅ Ｍｃ 是真核类生物细胞 中的一种异常结构 ， 往往是细胞经辐射或化学药 物的作用而产生 的（ｅｃ Ｍ，９ ７ 。微核是细胞的染色体发生断裂后 ， Ｆｎｈ １９ ） 细胞进入下一次分裂时 ， 染色体
喂水 。一周 后 ， 行 实验 。 进 ２ｏ ．％Ｎ维 菌素 乳油 （ ｖｒ ｃｎ ）山西科 峰 生物 科技 有 限公 司 提供 。将 ２ ％阿维 菌 素乳 油 与 丙酮 Ａ ｅｍｅｔ ｓ， ｉ ． ０ 按体 积 比 １ ０ ０配成 ００ ０％的浓 度 。 ：０ ４ ．０５
１１ 主要仪 器及 试剂 ．． ２
中保温 ２ ， 再加入 ３ ｈ ３ ｍＬ甲醇 ， 混匀后装入棕色瓶中保存备用 ， 贮存时间越久越好 。Ｇｅ ｓ 染色液（ ｉ ａ ｍ 染
色前临 时配 制 ）１０ｍＬＰ ：０ ＢＳ液稀 释 ３ ５ｍＬＧｅ ａ 液 ～ ｉｍｓ 原 吖啶橙染 色液 ： 称取 ０１ ．ｇ吖啶橙 加蒸 馏水 １０ｍＬ做母 液 ， ０ 放冰 箱备 用 。 其 他试剂 为 国产分 析纯 。
裂， 从而在胞浆 中形成 １ 个或数个小核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样 ， 也具合成 Ｄ Ａ Ｎ 的能力（ 余争平等 ，００ 。 ２ ０ ） 一般认为微核是 由有丝分裂后期丧失丝粒的断片产生的（ 高雪等 ，０ ４ 。 ２ ０ ） 微核 实验作为快速检测体 内染色体 畸变的方法 ， 已广泛应用于遗传 、 食品 、 药物、 环境等很多领域 ， 以其简 并 便、 迅速、 敏感为优点 ， 广泛用于辐射损伤、 工业管理、 药物筛选以及血液学等工作 的研究（ 曹佳 ，００ 。 ２０ ） 吉姆萨（ ｉ ｓ） Ｇ ｅ ａ染色法 ： ｍ 吉姆萨染液 由天青 ， 伊红组成 。 嗜酸 ｆ颗粒为碱性蛋 白质 ， 生 与酸『染料伊红 生 结合 ， 染粉红色 ， 称为嗜酸性物质 ； 细胞核蛋 白和淋 巴细胞胞浆为酸性 ， 与碱性染料美蓝或天青结合 ， 染 紫蓝 色 ， 为 嗜碱性 物质 ； 称 中性 颗粒 呈等 电状态 与伊 红和美 蓝均 可结 合 ， 淡紫 色 ， 中性 物质 。 染 为
通迅作者（ ｏｒｓｏ ｄａｔｅ）Ｅ ｍａ ：ｘｕｉ ＠１ ６ ｏ Ｃ ｒ ｐ ｎ ｈ ｒ， — ｉ ｓａｌ ｃ ２ ． ｍ ｅ ｕ ｌ ｓ ｔ 收稿 日期（ ｅｅ ｅ ） ｏ８０ ．８ Ｒ ｃｉ ｄ ： ０ ．８０ ｖ ２ 山西省青年基金 （０ ８２ ０ １ 、 ２ ０ ０ １４ ） 山西省科技攻关项 目（０ ８ ３ １２ ，０ ６３ ０ ８ 资助 ２０ ０ １０ ３ ２ ０ ０ １４ ）
于观 察 。 １２ 微核 的鉴 别 ．． ７
微 核位 于 细胞 质 中 ， 主细胞 核 分开 ； 状 呈 圆形或 椭 圆形 ， 缘 光滑 ； 色 性质 与 主 细胞 核 一致 ； 与 形 边 染 大小 为 主核 的 １３将含 有多个 微 核 的细胞记 为一个 微核 细胞 ） ／（ 。
２ 结 果 与 分 析
１２ 拍摄 蜘蛛 细胞 图片 ．． ５
吉姆萨染色法 ： ４ 在 ０×１０ 的荧光显微镜下用 自然光观察蜘蛛细胞涂 片， ０倍 调焦到蜘蛛细胞形态清
晰时， 进行 拍摄 ， ２ ０张 图片 。 拍 ０
１６ ２
蛛形 学 报 Ａｃ ａｈ ｏ ｇｃ ｉｉ ｔＡｒｃｎ ｌ ｉａ ｎｃ ａ ｏ Ｓ ａ
Ｖ０．７Ｎｏ ２ １１ ．
吖 啶橙荧 光染 色法 ：于绿色 荧光 下在 ４ ０×１０ 的荧 光 显微 镜下 观察 蜘蛛 细 胞涂 片 ，进行 调焦 观 ０倍 察 。 当视 野 中细胞形 态 清晰 时进行拍 摄 ， ２０张 图片 。 拍 ０ １ ． 观察 分析 蜘蛛 细胞 细胞 图片 ．６ ２ ２种染 色方法 处理 好 的蜘蛛 细胞 图片 的观察 。从未 染毒 的蜘 蛛细胞 图片找 出细 胞分 布集 中 ， 染色 均 匀、 清晰 、 背景杂质少的进行分析； 将染毒 的蜘蛛细胞图片挑选微核多而明显 ， 分布均匀集 中的图片以便
浸于染色缸中， 染色 １ ｉ 后晾干。Ｐ Ｓ ０ ｎ ｍ Ｂ 液起到稀释的作用 ， 吉姆萨染液须现用现配 。 吖啶橙 荧光染 色法 ： 涂有 蜘蛛细胞 涂 片的载 玻片用 甲醇 固定 １ ｎ 待 甲醇 挥发 干净后 ， 将 ５ ｍｉ， 现配 １ ｍＬ 母 液加 １１ 磷 酸缓 冲液 （Ｈ＝４８ ９ ／５ Ｍ ｐ ．） 将 玻 片浸 于染 色缸 中 ， 色 １ ｎ 晾 干 。 ｍＬ， 染 ０ｍｉ， 吖啶橙 是一 种荧 光
关键词 ： 星豹蛛 ； 微核 ； Ｎ Ｄ Ａ损伤 ； 吉姆萨染色法 ； 吖啶橙染色法
月 Ｕ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
吾
星豹 蛛 Ｐ ｒｏａａｔｉｅａＬ Ｋｏｈ广泛分 布 于我 省各 地 ， ａ ｄｓ ｓｒｇｒ ． ｃ 主要 活动 于干 旱地 区。能 捕食农 田 、 园 果 以及菜田等多种农作物害虫。它具有种群数量大 ， 分布广 ， 体型较大 ， 捕食量大 ； 成虫寿命长 ， 繁殖力强 ，
１ 实验方 法 ． ２
ｌ ． 单 细胞悬 液 的制备 －１ ２
将活体蜘蛛用 ７％的酒精 冲洗 ３ ， ５ 次 再用不锈钢剪刀将其剪碎 ， １０ 加 ０ Ｌ生理盐水到玻璃匀浆器 研磨并过 ２ ０目筛得单细胞悬液 ， ０ 用苔盼蓝排斥法镜检细胞存活率达 ９ ％以上。 ５
１２ 阿维 菌素致 Ｄ ．． ２ ＮＡ断裂 作用 的研 究
片段 不 能 随有 丝分 裂 进入 子 细胞 ， 在细 胞浆 中形成 直 径小 于 主核 的 、 色 与主核 一 致 、 全 与 主核分 而 嗜 完
开的圆形或椭圆形微小核（ 王昱等 ，０３ 。位于细胞浆 中独立于主核的核小体 ， ２０ ） 其染色 同主核 ， 比主核 但
淡， 其直 径小 于 主核 ｌ ， ／ 主要 由外 界损 害 因素（ 物 、 理 、 ３ 生 物 化学 ） 作用 细胞 后 ， 导致 细胞 染 色体 丢失 或 断
Ｎ ｖ ２０ ｏ． ０８ ，
李 锐等：种染色方法在微核试验 ２
堑
法： 该方法属于荧光染色法的一种 ， 吖啶橙可插入 Ｄ Ａ和双链 Ｒ Ａ的双螺旋结构内的碱基对之间 ， Ｎ Ｎ 此 染料是碱性荧光探针可与多核苷酸链上的酸 ｆ磷酸基团之间借静 电结合（ 生 王天有等，０６ ｏ ２ ０ 本文采用微核实验方法来检测蜘蛛血细胞 Ｄ Ａ的损伤作用 ， Ｎ 同时 比较 了 ２ 种染色方法对对试验结
２１ 对 照组 ２种染 色方 法 的比较 ．
图 １吉姆萨染色法观察对照组蜘蛛血细胞结构
果 的影 响 。
ｌ 材 料 与 实验 方 法
１１ 材 料 ．
１１１供试 材料 ．．
星豹蛛， 供试材料为采 自山西农业大学苹果园的星豹蛛 ， 活体带回实验室 ， 将 每头蜘蛛分装在 １ 个 指形 管 内 ， 内放一 蘸水 的脱 脂棉 以供 蜘蛛 饮 用 。为 防外 缘 Ｄ 管 ＮＡ 的干扰 ， 本 要饥 饿一 周 ， 间每 天 只 标 其
荧光 ，与 Ｒ ＮＡ结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性 ，能透过细胞膜 ，使核 Ｄ Ａ和 Ｎ
Ｒ Ａ染色。因此 ， Ｎ 在荧光显微镜下观察 ， 吖啶橙可透过正常细胞膜 ， 使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光 ； 而在凋亡细胞中， 因染色质固缩或断裂为大小不等 的片断 ， 形成凋亡小体 。吖啶橙使其染上致密浓染的 黄绿色荧光 ， 或黄绿色碎片颗粒 ； 而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。 吖啶橙 Ａ Ｏ常与溴化乙啶 Ｅ Ｂ合用双 染， Ｅ 因 Ｂ只染死细胞使之产生桔黄色荧光 ， 由此可区分出正常细胞、 凋亡细胞及坏死细胞。吖啶橙染色
数显电热恒温水浴箱（ 北京市长风仪器仪表公 司）低温冷冻离心机（ ＩＭＡ）Ｂ ５ 型成像显微镜 ， ＳＧ ，Ｘ １
（ Ｌ ＭＰ Ｏ Ｙ ＵＳ公 司 ）玻璃 匀浆 器等 。 ， Ｇｉ ａ原液 ： Ｇｉ ａ ０５ｇ加 入 ３ ｅ ｍｓ 取 ｅ 粉 ． ｍｓ ３ｍＬ优 质丙 三 醇 于研 钵 中 ， 分 研磨 １ ， 充 然后 在 ５ ｈ ６℃温 箱
蛛 形 学 报 Ａｃ ａｈ ｏｏｉａ ｉｉ ， ｖ ２ ０ ， （ ）１４ １８ ｔＡｒｃｎ ｌｇｃ ｎｃ Ｎｏ ．０ ８１ ２ ：２ —２ ａ Ｓ ａ ７
１Ｓ ０ ５９ ２ Ｓ Ｎ １０ —６ ８
２种染 色方法在微核试验 中的比较
李 锐 李生才 刘 佳 罗 原
山西农业大学农学 院 太谷 ０ ０ ０ ３８１
摘 要： Ｎ Ｄ Ａ存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息 ， 维护 Ｄ Ａ分子的完整性对细胞至关紧要。 Ｎ 外界环 境和生物体 内部 的因素都会导致 Ｄ Ａ分子的损伤或改变 ， Ｎ 微核试验是检测外来化合物对染色体损伤作用 的重
要方法 ， 已在国内外普遍应用 。蜘蛛是许多农 、 林害虫 的天敌 ， 在生物防治中起重要作用 ， 保护和利用蜘蛛 已成 为生物防治 的一项重要 内容。本文主要是通 过 ２ 种染色方法吉姆萨染色法 和吖啶橙染色法对蜘蛛血细胞进行 微核试 验 ， 比较 ２ 种染色方法 的优劣。
吖 啶橙 （ ｃｉｉｅ ａｇ ， Ｏ） １ 荧 光 色 素 ， 检 测 激 发 滤 光 片 波 长 ４８ｎ 阻 断 滤 光 片 波 长 Ａ ｒ ｎ ｎｅＡ 是 种 ｄ Ｏｒ 其 ８ ｍ， ５５ｎ １ ｍ。它 与细 胞 中 Ｄ ＮＡ 和 Ｒ ＮＡ结 合量 存在 差别 ， 发 出不 同颜 色 的荧光 ， Ｄ 可 与 ＮＡ结合 量 少 发绿 色
将制成的细胞悬液分装于 ３ １ 支 ．ｍＬ的离心管 中， ５ 均加入终浓度为 ０ ０５ ． ０％的阿维菌素溶液 ， ０ 轻轻
混匀 。 ３支 离心 管置 于室 温下 ， 染毒 ３ ｎ 重复 ３次 。 ０ ｍｉ。 制成 的细 胞悬 液分 装 于 ３ １ 支 ．ｍＬ的离心 管 中 ， ５ 为 阴性 对 照组 ， ３支离 心管 置 于室温 下 。重 复 ３ 。 将 次 １ ． 蜘蛛 细胞 涂片 的制 备 ．３ ２ 将 细胞 悬浮 液在 预冷 的载 玻片 上进 行涂 片 。 １ ． 蜘蛛细 胞涂 片 的染色 ．４ ２ Ｇｉ ａ ｅ 染色 法 ： 涂有 蜘 蛛细胞 涂 片 的载玻 片用 甲醇 固定 １ ｎ 固定好 的 细胞涂 片待 甲醇 挥 发干 ｍｓ 将 ５ ｍｉ， 净后 ， 用 Ｐ 再 ＢＳ液 （Ｈ＝６８ 稀 释 的 Ｇｉ ａ５１， 释 染 色必 须 用缓 冲液 ， 冲 液 ｐ ｐ ．） ｅ （： 稀 ｍｓ ） 缓 Ｈ值 要 准 确 ， 否则 影 响染色 效果 ， 冲洗 用水 应 近 中性 ， 则可 导致 细 胞染 色反 应 异 常 ， 否 以致识 别 困难 ， 至 造成 错误 。将玻 片 甚
色 素 ， 与细 胞 中 Ｄ 它 ＮＡ 和 Ｒ ＮＡ结 合 量 存 在 差 别 ， 可发 出不 同颜 色 的荧 光 （ 即着 色 特 异 性 ）这 是 由于 ，
Ｄ Ａ是个高度聚合物 ， Ｎ 吸收荧光物质 的位置较少 ， 发绿色荧光 ， Ｒ Ａ聚合度低 ， 而 Ｎ 能和荧光物质结合的 位置多 ， 故发红色荧光。吖啶橙染液有毒 ， 操作时要戴手套 ， 需避光。