第七章 体内药物浓度法(已修改)

归一化法
优点：方法简便，结果比较准确，定量结果与 进样量无关，操作条件变化对结果影响较小。 缺点：所有组分都必须在在操作时间内流出色 谱柱，且检测器对它们都产生信号。
（2）内标法： 是指向样品溶液中准确加入一
定量的纯物质作内标物进行液相分析，根据样 品和内标物的重量及其相应的峰面积之比，求 出待测组分含量。
对内标物的要求： ① 内标物在结构上或官能团类型上与被测组分相 似，但应为原样品中所不含有的组分，否则会使 峰重叠而无法准确测量内标物的峰面积。
②内标物的保留时间应与待测组分相近，但能完 全分开。 ③内标物必须是纯度合乎要求的纯物质。
内标法具备归一化法的优点，只要被测组分与
内标物产生信号即可定量，结果比较准确，不 需准确进样，很适合于中草药及其复方某些有 效成分的血药浓度测定。 缺点：每次分析都要准确称量样品和内标物的 重量，而且理想的内标物不易寻找。
1.实验部分 1.1标准曲线制备 精密称取丹皮酚4mg臵25ml容量 瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度(0.16mg/ml)。 分别吸取5、10、20、40、80、120μl臵具塞离 心管中，分别加入苯乙酮溶液15μl；加兔血浆 1ml，乙腈5ml，补加蒸馏水至8ml，混匀，离心 (2000r/min)15min 。上层液通过 SPE C18 ，取收 集液进样20μl，测量峰高，计算丹皮酚与苯乙 酮的峰高比。用最小二乘法回归，得浓度对峰 高比的回归方程为：
内源性物质的干扰。
三、准确度高，精密度高
四、快速、简便
第三节 常用的中药体内药物 浓度测定方法
一、分光光度法
（一） 紫外分光光度法
（二） 荧光分光光度法
（三） 原子吸收光谱法
二、色 谱 法
（一）薄层层析（TLC）法
（二）高效液相（HPLC）法
（三）气相色谱（GC）法
高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）
表7-18
时间（min） 2 5 10 15 20 30 45 60 90 120 180 240 360
静注后不同时间兔血浆中丹皮酚浓度
浓度（ug/ml血浆） No 1 No 2 No 3 33.03 32.60 31.20 18.80 17.53 13.92 16.30 16.99 11.94 12.99 11.19 9.15 10.83 8.29 8.45 9.20 8.02 7.28 8.53 7.76 6.41 6.70 6.24 5.75 3.79 3.97 3.29 3.35 3.23 2.76 1.25 1.31 1.21 0.90 0.98 0.97 0.78 0.87 0.82
分别取上述各时间的血浆1ml，臵具塞离心管
中，加乙腈5ml，苯乙酮溶液 15μl，混合后补 加蒸馏水至 8ml ，混合。其余操作同标准曲线 项下。 测定丹皮酚与内标物的峰高比，代入回归方程 计算血药浓度（见表 7-18 ），并绘制药 - 时曲 线（见图7-9）。

对3只家兔静注后6h体内丹皮酚血浆浓度测定 的数据用计算机按两室模型进行处理，得药物 动力学参数（见表7-19）。
非极性
液、液分配 色谱(反相) 液、固吸附 色 谱
化学键合 相 C18 硅胶 5~100μ
甲醇-水 乙腈-水 乙烷-极性 溶 剂
溶于有 机溶剂
ຫໍສະໝຸດ Baidu
中等极 性
强极 性
分子量 <1000 非离子 型 溶于水
液、液分配 色谱(正相)
液、液分配 色谱(反相) 阴离子交 换
YWGNH2
化学键合 相 C18 Partisil SAX
2.碱性药物及其盐
3. 中性药物 脂溶性样品
③薄层色谱或预柱色谱分离
活性碳 氧化铝 离子交换树脂等
填充剂
④膜过滤法：以一定大小孔径的微孔膜，除去一 定分子量以上的物质如蛋白质、细胞等。
（2）衍生物制备：对于无紫外和荧光吸收的药 物可采用化学衍生法。将样品经过简单的处理， 引入对紫外或荧光吸收性强的发色团，使其生 成在紫外区有强吸收或能发射荧光的衍生物， 提高检测灵敏度和选择性。包括柱前和柱后衍 生 。
是在经典液相色谱和气象色谱的理论与技 术上发展起来的一种现代化色谱分析方法。该 法由于采用高效固定相、高压输液泵、高灵敏 检测器等新技术，从而成为色谱法中应用最为 广泛的一种分析方法。具有样品适用范围广， 预处理简单，快速，灵敏，专一等优点。
1. HPLC法的选择
高效液相色谱法的种类较多，包括液-固吸 附色谱法、液-液分配色谱法（正相或反相）、 离子交换色谱法、离子对色谱法、凝胶色谱法。 选择色谱方法必须考虑所分离化合物的化学结 构和溶解度。关于选择各类高效液相色谱法的 原则见下图。
③扫描型：不仅可选择波长，还有快速扫描装
臵，记录组分的吸收光谱，使定性分析更方便。
④光电二极管阵列型：一次操作可获得包括
波长、吸收值和时间在内的三维谱图，还可得 到难分离组分重叠峰的有关信息。
荧光检测器（FLD）：相当于一台荧光光度计。 基于某些荧光物质吸收一定波长紫外光后发射 出荧光，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。
CX AX CS AS
外标一点法要求进样量准确及测试条件恒定。
实例1
兔血浆中丹皮酚的高效液相色谱法测定
[按] 本例采用HPLC内标测定法，请注意内标 物苯乙酮选择的基本要求： 其在化学结构上与被测物质丹皮酚相似， 但又非原样品中所含有的组分， 两者的保留时间相近，但又能完全分开。 因丹皮酚具有挥发性，故在血样处理时采用了 乙腈沉淀法。结果较为满意，可供类似成分药 物动力学研究参考。
第二章
第一节
体内药物浓度法
体内药物浓度测定样本与实验动物 种属的选择
第二节 第三节
建立中药体内药物浓度测定方法的
技术要求
常用的中药体内药物浓度测定方法
第一节 测定样本与实验动物种 属的选择
对于有效成分明确且有效成熟的定量分析方法测定的中药，可采用此法。 一、测定样本 常用的测定样本有： 血液（血浆、血清、全血）、 尿液、 唾液、 泪液（眼用制剂）、
Y = 15.151X - 0.00382
(n=6)， r =0.9973
1.2兔血浆中丹皮酚浓度的测定 丹皮酚溶液的制备：称取丹皮酚 300mg ，以无 水乙醇 10ml 溶解，再加 1,2- 丙二醇 7ml 混合。 此液逐渐加到灭菌蒸馏水中至 30ml，过滤。滤 液于100℃，30min灭菌即得。
测定方法：准确称量样品M克，取一纯物质
（内标物）适量Ms，加入样品中，混匀，进样。 根据待测组分i的峰面积（Ai）及内标物的峰 面积（As），依据下列关系可求出样品中i组 分的百分含量Ci%。
因为
Mi Ai f i Ms As f s
Mi Ci % 100% M
所以
Ai f i M s Ci % 100% As f s M
选择体重在2.5kg以上New Zaland兔3只，
按30mg/kg由耳静脉注射丹皮酚溶液，
然后在 2 、 5 、 15 、 20 、 30 、 45 、 60 、 90 、 120 、 180 、 240 和 360min 时取血，并立即离心 (2000 r/min)10min，分离血浆。
平均 32.48 16.75 15.08 11.11 9.19 8.17 7.56 6.17 3.62 3.11 1.26 0.95 0.82
表7-19
K12
静脉注射丹皮酚溶液兔体内药物动力学参数
K21 K10 T1/2（） T1/2（） Vα
22.45 14.19 23.67 20.10 AUC （min） （L） （ L/h） （h·μg/ml） 16.22 53.72 21.96 30.63 5.32 6.44 5.85 5.87 23.13 18.63 20.52 20.76
①除去蛋白质等其它干扰物质，加入沉淀剂改变 蛋白质等电点
②溶剂提取法
酸性物质酸化 碱性物质碱化 然后用与水不相溶的溶剂 提取
表（7-16）列出了一般药品的提取方法。
表7-16 一般药品提取方法 样品性质 水溶性样品 1.酸性药物及其盐 提取方法 有机溶剂提取杂质后调成酸性,再加入有 机溶剂提取,或在N2流吹下,用适当溶剂溶 解后进样。 有机溶剂提取杂质后调成碱性，再加入有 机溶剂提取，可直接进样，或在N2流下吹干， 用适当溶剂溶解后进样。 有机溶剂提取后，直接用反相色谱法分析。 有机溶剂提取后，或进样，或在N2流下吹 干，用适当溶剂溶解后进样。
柱前衍生：将样品制备成衍生物后再进样，此
法不改变仪器结构，但分离度较差； 柱后衍生：色谱柱流出液与反应液柱后混合， 反应后再进入检测器。此法需改变仪器结构， 但分离度高。
例如：
a. 十二烷基硫磺酸钠作胶束试剂使延胡索乙素 的荧光强度增大5.5倍。
b. -CD包合物增敏荧光法可降低秦皮甲、乙素
乳汁（乳汁排除药物对乳儿的影响）、
脏器匀浆等.
二、实验动物的选择
1、尽可能与药理学、毒理学研究一致，以便联系 药效学进行分析讨论。
2、最好从同一只动物多次采样，采样时间为自变 量，必须准确，操作迅速。
3、小鼠、大鼠、兔（口服不用）、犬较为常用。
第二节
一、灵敏度高 二、专一性强
测定方法的技术要求
血药浓度常在ng/ml级 。 能排除药物代谢产物及机体
实例2
三维 HPLC 等四谱研究川芎伍用丹参煎剂对 川芎嗪药物动力学的影响
中药复方成分复杂，特异性是其浓度测定方法的 难点，本例选用多种先进分析仪器，较好的地决 了这一问题。对比分析图（7-10）A、B、C所示各 峰形，结合结果部分文字说明，体会实验方案设 计的思路。其中关于如何判断样品预处理去除蛋 白的效果，以及关于四谱鉴定样品来源的确认都 具有一定的启迪作用。
（3）外标法：内标物不易选定时，可用外标法。 外标法又分工作曲线法与外标一点法等。
工作曲线法：配制欲定量组分对照品一系列浓 度的标准溶液，准确进样，测量其峰高或峰面 积。以峰高或峰面积对标准液的浓度绘制工作 曲线。然后再按相同操作条件进行样品测定， 测出待测组分的峰高或峰面积，利用工作曲线 定量。
的最低检出浓度，进行微量痕量检测。
4. 常见定量法
（1）归一化法： 将样品中所有出峰组分含量之 和作为100%，求出其中某一组分含量百分数的 方法。计算公式为：
A1 f1 C1 100% A1 f1 A2 f 2 … An f n
其中 Ci%：i组分的重量百分含量
fi： i组分的校正因子（由于检测器对各 组分的灵敏度不同，同样浓度在色谱图上呈现 的面积并不相同，因此应校正。fi可通过有关 手册查到 。）
二氯甲烷 等
甲醇-水 乙腈-水 磷酸盐缓 冲液
样 品
离子型
离 子 对 色谱
阳离子交 换
化学键合 相 C18
Partisil SCX
甲醇-水（含 反离子）
磷酸盐缓 冲液
分子量 >10000
凝胶色谱
2. 检测器的分类及选择
紫外检测器（UVD）：主要有以下几种类型： ①固定波长型：用得较多的是波长为254nm的紫 外光。因大多数芳香族、芳杂环、稠芳环等在 此处均有吸收。 ②可调波长型：相当于一台紫外可见分光光度计。 由于波长可任意调整，可以选择试样的最大吸 收波长进行检测，提高灵敏度。
蒸发光散射检测器（ELSD）：其基本原理是样 品气化后，溶质粒子的散射光强度与其浓度成 正比。 此外还有视差折光检测器、电化学检测器等。
3. 样品预处理技术
（1）试样的预处理：生物样品中含有蛋白质和 其它干扰物质，处理不好直接影响柱子的寿命 和柱效。另外体液中药物及代谢产物含量很低， 还需尽可能加以浓缩。
外标一点法：工作曲线法计算含量时会出现
两种情况：标准曲线过原点，截距为零；标准 曲线不过原点，截距不为零，说明系统存在误 差。当截距为零时，可用外标一点法定量。 C C
A
A
定义：用已知浓度的标准溶液，同量进样多
次，算出峰面积平均值，然后取样品溶液在相 同条件下操作，所测得的峰面积按下式计算含 量：
Q
（h-1） （h-1） （h-1） （h）
1 0.5903 0.6382 0.9512 2.1141 2 1.6781 0.3407 1.0311 5.7798 3 0.6296 0.5865 0.8114 2.5581 平均 0.966 0.5218 0.9312 3.484
2. 讨论
通过残数平方和与拟合度计算，丹皮酚静脉注射 给药为双室模型。 分布半衰期仅20min，说明该药进入体内很快分布 到有关器官和组织，迅速发挥药效。 消除半衰期是 3.5h 左右，表明在体内停留时间不 长。 从药物动力学参数可以看出，丹皮酚在兔体内动 力学参数存在一定的个体差异。