新型水溶性多色荧光碳点的制备及细胞成像研究

Preparation of Novel Water Soluble Multicolor Carbon Dots for Cell Imaging
2 LI Xintong1， ，WU Jing1* ，ZHANG Demeng2 ，TAN Mingqian2* ，MA Xiaojun2
（ 1． School of Chemistry and Chemical Engineering，Liaoning Normal University，Dalian 116029 ，China； 2． Laboratory of Biomedical Material Engineering，Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023 ，China）
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实验方法
碳点的制备 将 1 g 葡萄糖溶于 2 mL 去离子水中，加入 15 g 鸡蛋清或牛奶， 超声 5 min 使之 混合均匀。将混合好的溶液置于 50 mL 水热反应釜中，马弗炉程序升温 1 h 从室温升至 200 ℃ ，反应 5 h 后，自然冷却至室温。 反 应 结 束 后， 得 到 的 褐 色 澄 清 溶 液， 即 为 粗 产 品 碳 点。 将 粗 产 品 经 4 000
新型水溶性多色荧光碳点的制备及细胞成像研究
1， 2 李欣彤 ，吴 1* 2 2* 2 晶 ，张德蒙 ，谭明乾 ，马小军
（ 1． 辽宁师范大学
化学化工学院，辽宁
大连 116029 ； 2． 中国科学院大连化学物理研究所 大连 116023 ）
生物技术部，辽宁 摘
要： 以鸡蛋清和牛奶分别与葡萄糖进行水热反应，制备水溶性多色荧光碳点，通过膜和柱层析分离纯
第 33 卷 第 4 期 2014 年 4 月
分析Fra Baidu bibliotek试学报 FENXI CESHI XUEBAO（ Journal of Instrumental Analysis）
Vol. 33 No. 4 380 ～ 386
doi： 10. 3969 / j. issn. 1004 － 4957. 2014. 04. 003
Abstract： Two types of watersoluble multicolor carbon dots （ CDs ） were prepared through the reactions of egg white or milk with glucose by hydrothermal method． The CDs derived from egg white / glucose （ E － CDs） and milk / glucose（ M － CDs） were purified by filtering membrane and column chromatography． Particle sizes， UV － vis absorption and emission spectra and surface groups of the two types of CDs were characterized using transmission electron microscopy （ TEM） ，ultraviolet spectrometry（ UV ） ， fluorescence spectroscopy （ FL ） ， Fourier transform infrared spectroscopy （ FTIＲ ） techniques，and their multicolor cell imaging were evaluated by incubation with mouse melanoma cells． The results showed that the two types of multicolor CDs prepared by hydrothermal method were highly watersoluble with particles sizes of 2. 5 nm and 4. 9 nm，respectively，which could emit bright multicolor fluorescence under the excitation of UV － vis light． Their maximum absorption wavelength was 250 nm，whereas the maximum fluorescence emission wavelengths were located at 410 nm and 400 nm for E － CDs and M － CDs， respectively． Meanwhile ， the obtained CDs exhibited upconversion fluorescence properties in the excitation wavelength range of 660 － 800 nm． The emission peak positions from both CDs shifted to longer wavelengths，and the intensity gradually decreased with the increase of excitation wavelengths． FTIＲ spectra analysis revealed the presence of —COOH，—NH2 and —OH on both of CDs’surface． Cell imaging results demonstrated that fluorescence in the cells cultured with CDs was clearly visible under 405 nm and 488 nm laser irradiation ， respectively， and both of the CDs showed very low cytotoxicity when the CDs’concentration was less than 2. 5 mg / mL．
第4 期
李欣彤等： 新型水溶性多色荧光碳点的制备及细胞成像研究
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Key words： water soluble fluorescent carbon dots； fluorescent probe ； cell imaging 近年来，碳纳米管、纳米纤维、氧化石墨烯、富勒烯和荧光碳点 （ 以下简称碳点 ） 等碳纳米材料在 新能源、生物医学、环境保护、化学传感器以及航空航天等诸多领域展现出巨大的应用潜力， 因此受 。其中碳点是一类具有荧光发射功能的纳米尺寸的碳球 。与传统的半导 到了研究者的广泛关注 体荧光量子点不同，碳点不含重金属元素，其主要组成成分碳是构成生命体的主要元素之一， 具有更 和更好的生物相容性 。 此外， 碳点还具有发射光谱可调谐、 光稳定性好以及上转 ［11 ］ 换发光 等特点，在生物医学领域显示了更大的应用前景 。 低的生物毒性 自 2006 年荧光碳点首次被报道以来，研究者已发展了电弧放电法、激光消融法、 强酸 / 碱氧化法、 ［13 － 17 ］ 等各种制备方法。在这些制备方法中， 水热反应和 电化学法、水热反应法、微波辅助法及超声法 微波辅助法因具有设备简单、操作便捷和合成效率高等优点被广泛采用。 另外， 石墨烯、 蜡烛灰、 草 ［18 － 19 ］ ［20 ］ ［21 ］ 已经被用作碳源制备碳点， 青草 和橙汁 等也可用作制备碳点 木灰和柠檬酸等有机物小分子 的碳源，这些研究结果提示日常生活中的一些食品 性能，用于生物医学领域。
收稿日期： 2013 － 10 － 30 ； 修回日期： 2013 － 12 － 27 基金项 目： 国 家 自 然 科 学 基 金 （ 91227126 ） ； 国 家 重 大 科 学 仪 器 设 备 开 发 专 项 项 目 （ 2013YQ17046307 ） ； 辽 宁 省 自 然 科 学 基 金 （ 2013020177 ） * 通讯作者： 吴 晶，博士，讲师，研究方向： 生物探针的设计合成，Tel： 13591380253 ，E － mail： wujing_ 0327@ hotmail. com 谭明乾，博士，副研究员，研究方向： 分子影像，Tel： 0411 － 84379139 ，E － mail： mqtan@ dicp. ac. cn
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实验部分
试剂与仪器
鸡蛋清由市售新鲜鸡蛋经蛋黄分离后获得 ，牛奶（ 蒙牛公司， 内蒙古， 袋装 ） ， 葡聚糖 G － 25 凝胶 （ 上海叶源生物有限公司） ； 葡萄糖（ 天津大茂化学试剂有限公司 ） 、硫酸奎宁 （ 阿拉丁 ） 、 氢氧化钠 （ 天 津大茂化学试剂有限公司） 、磷酸（ 天津恒兴化学试剂有限公司 ） 、 硼酸 （ 天津保地化学试剂有限公司 ） 均为分析纯； 小鼠黑色素瘤细胞（ B16 － F10 ） （ 南京凯基生物科技发展有限公司） 。 聚四氟乙烯内衬水热合成釜（ 50 mL，河南巩义予华仪器责任有限公司 ） ， 细胞培养皿 （ 北京浩轩文 生物科技有限公司） ，LS55 荧光分光光度计 （ 美国 PerkinElmer ） ， Burker Vector 22 傅立叶红外光谱仪 （ 德国布鲁克） ，场致发射透射电子显微镜 JEM － 2100 （ 日本 JEOL ） ， UV － 2550 紫外分光光度计 （ 日本 岛津） ，Wellscan Mk3 酶标仪（ 芬兰 Labsystems dragon ） ， 马弗炉 （ 天津市中环实验电炉有限公司 ） ， FV 1000 共聚焦荧光显微镜 （ 日本 Olympus Corporation ） ， Zetasizer Nano ZS90 动态光散射纳米粒度分析仪 （ 英国 Malvern） 。
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也许可以用作碳源制备碳点， 以获得较好的荧光
基于这一设想，本研究以市售的鸡蛋清或牛奶为碳源， 分别与葡萄糖发生水热反应， 制备新型的 水溶性碳点。牛奶和鸡蛋清作为人们日常生活中经常食用的蛋白质 ， 其分子中含有丰富的氨基， 可与 葡萄糖中的醛基在高温水热反应中发生缩合反应 ， 进而生成具有光致发光性质的碳点。 该反应原料全 部来源于食物，不掺杂任何有毒的化学试剂和重金属离子。 所制备的新型水溶性多色荧光碳点具有良 好的荧光性质，有望用于体外细胞成像等相关生物医学领域 。
化，利用透射电子显微镜（ TEM） 、紫外吸收光谱（ UV） 、荧光光谱（ FL） 、红外光谱（ FTIＲ） 等技术对所制备碳 纳米粒子的粒径大小 、吸收光谱、发光性质、表面基团进行表征。将所制备的碳点与小鼠黑色素瘤细胞共孵 育，进行细胞成像应用评价 。结果表明： 制备的两种水溶性荧光碳点平均粒径分别为 2. 5 nm 和 4. 9 nm，可 在紫外灯下发出明亮的荧光，紫外最大吸收波长为 250 nm。基于鸡蛋清或牛奶与葡萄糖反应制备的多色荧光 碳量子点具有良好水溶性，其荧光光谱最大发射波长分别在 410 nm 和 400 nm 处，同时在 660 ～ 800 nm 激发 波长范围内具有上转换性质，且荧光发射光谱随着激发光波长的增加发生红移 。红外光谱表明存在—COOH、 —NH2 和—OH 基团。细胞成像结果表明，在 405 nm 或 488 nm 激光照射下，所制备的碳点在细胞内的荧光成 像清晰可见，而且在碳点浓度小于 2. 5 mg / mL 时，均表现出较低的细胞毒性 。 关键词： 水溶性荧光碳点； 多色荧光； 细胞成像 中图分类号： O657. 3 ； Q233 文献标识码： A 文章编号： 1004 － 4957 （ 2014 ） 04 － 0380 － 07