药敏实验流程

药敏实验

1.目的

提供细菌对抗菌药物的敏感试验的标准采集与操作方法，选择敏感药物用于临床。

2.范围

适用于实验室分离菌及常见菌的抗菌药物敏感试验。

3.采样对接人

服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。

4.设备和材料

无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次

性手套、营养琼脂培养基、M-H琼脂培养基或特殊培养基、0.5

标准麦氏比浊管、药敏纸片、待测病料、记号笔、眼科镊子、

2ml或5ml一次性注射器、试管架、超净工作台、恒温培养箱、带刻度直尺。

5.采样及送样操作

采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目的进行采样→保证组织完整性→独立存放到封口袋中并做好标记。

运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，不可冷冻。

常见细菌分离采样部位

病名样品

链球菌脑、腹腔积液

葡萄球菌/大肠杆菌肝脏、心脏、肺脏、脾脏、肾脏霉菌肺脏

副猪嗜血杆菌脑、呼吸道分泌物、胸腹腔积液

5.1样品的标识

要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果抽样日期及周龄、检测项目等内容。

5.2采样数量

猪一般采集3-5头，

6.细菌分离

在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒温培养箱中培养18-24h后备用。

细菌在培养基上生长特点

7.药敏试验操作步骤

7.1制作待检菌液

在超净工作台内挑取培养18-24h普通营养琼脂平板上的菌落，悬于含3ml无菌生理盐水的试管中。混匀后与比浊管比浊，调整浊度至0.5麦氏标准（相当于1-2*10 cfu/ml）。

7.2接种细菌

在超净工作台内用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余的菌液，均匀涂抹整个平板表面，最后沿平板内缘涂抹一周（用接种环密集划线法也可以）。

7.3贴药敏片

将涂抹均匀的培养皿底部用记号笔做好标记，眼科镊子在酒精

灯上灼烧灭菌待冷却后，镊取各种购买或自制的药敏片，分别贴于

相应的位置上，用镊子轻轻按压纸片使药敏纸片与培养基表面密贴；药敏纸片应在培养基表面均匀分布，各纸片中心距离大于24mm，纸

片距边缘距离大于15mm，这样一个直径90mm的培养皿可贴7个药

敏纸片。

7.4培养

最后将贴好药敏纸片的平板倒置放于37℃±1℃恒温培养箱培

养16-18h后取出观察结果。

8结果观察与判定

8.1抑菌圈直径观察

抑菌圈直径以肉眼见不到细菌明显生长的边缘为限（变形杆菌

可蔓延生长至某些抗微生物的抑菌圈内，表现为一种细薄微弱的生长，形成一层明显的抑制性生长环，对于这种情况应忽略不计；对

于磺胺类药物，应忽略抑菌圈内轻微的细菌生长，少于20%的菌苔，以明显的边缘为抑菌圈直径）。

8.2根据药敏片周围抑菌圈的大小，判定药物的敏感度

敏感：表示被测菌株所引起的感染可以用常用量该抗菌药物治愈。

中介：表示被测菌株对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率

低于敏感菌株，使用高于正常给药量有疗效。

耐药：表示被测菌株不能被常用剂量药物抑制，临床疗效不佳。

8.3判定

不同菌株结果判定标准不同；不同药物判定标准不同。最终判定结

果应以WS/T125-1999列表中对应的标准为准。也可以根据以下标准

进行判定：

9.注意事项

9.1要求待检病料新鲜、无污染。

9.2整个试验操作过程注意无菌操作。

9.3培养基厚度：要求厚度为4mm，直径90mm的培养皿约25ml/平皿；菌液一定要比浊；尽量选用同一品牌、大小相同的棉拭子涂布细菌；自制药敏片的厚度必须是新华1号滤纸。

9.4药敏片保存：长时间不用放于-20冷冻保存，平时常用可放于4-8℃冷藏；药敏片从冰箱拿出要与室温平衡20min后打开盖使用，以免潮湿影响结果。

10.参考文献

10.1《六和养殖事业部化验室标准操作规程（SOP）》-2007版。

10.2《纸片法抗菌药物敏感试验标准》WS/T 125-1999。