《医疗器械免疫原性评价方法第6部分用流式细胞术测定

《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾

脏淋巴细胞亚群》标准编制说明

一、工作简况

1.任务来源

根据2018年医疗器械标准制修订工作安排，由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口，山东省医疗器械产品质量检验中心、北京市医疗器械检验所负责制订YY1465.6《医疗器械免疫原性评价方法第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群》。2.标准体系

YY/T1465的总标题是医疗器械免疫原性评价方法，包括以下部分：

—第1部分：体外T淋巴细胞转化试验；

—第2部分：血清免疫球蛋白和补体成分测定ELISA法；

—第3部分：空斑形成细胞测定琼脂固相法；

—第4部分：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验半体内法；

—第5部分：用M86单克隆抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率；

—第6部分：用流式细胞术测定动物脾脏淋巴细胞亚群。

有关其他方面的免疫原性试验将有其他部分的标准。

3.工作过程

在接到标准制定任务后，标准起草工作组认真研究，于2018年3月召开首次视频工作组会议，召集共同验证单位确定工作组讨论稿和标准验证方案。在分析验证结果和对标准内容进行充分讨论后,工作组于7月底完成并发出征求意见稿。

二、标准编制原则和确定标准主要内容的论据。

标准修订工作组按照GB/T1.1—2009的规则制定本部分。

1、医疗器械中免疫原的来源

免疫原即医疗器械中所含有的，可以刺激机体发生免疫应答的异源性物质。蛋白质作为免疫原性物质的可能性最大，其次是多糖，核酸和脂质等。小分子量的物质通常没有免疫原性，然而，它们可以通过与宿主蛋白结合并改变蛋白的构象来获得免疫原性。对于医疗器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金属材料可能具有的溶出物、磨损或可降解部分能够与宿主蛋白结合。生物源性的材料，如胶原，天然乳胶蛋白，白蛋白和动物组织等都可以刺激机体发

生免疫应答。

2、国际上对医疗器械免疫毒性评价的要求

医疗器械中所含的免疫原性物质是导致其免疫毒性的原因。对于免疫毒性评价的要求，各国的要求不尽相同。欧盟法规部门为免疫毒理学评定提供两个选择方案：或通过流式检测淋巴细胞表面标志物及自然杀伤细胞（NK）活性或是评价针对某一T细胞依赖性抗原的抗体应答反应。2002年，FDA出台了一份名为“企业指南：研究性新药的免疫学评价”的文件，该文件中要求在临床前动物研究中缺乏免疫相关变化证据的情况下，无需进行免疫功能试验。我国在2010年等同转化了国际标准ISO/TS10993-20：2006，该标准为医疗器械免疫毒理学试验提供指南，但缺少具体的试验方法。

3、流式细胞仪(Flow cytometer，FCM)试验原理

FCM是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。在免疫学研究领域，FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面，尤其是与单克隆抗体技术的结合，使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用，成为现代免疫学研究不可缺少的工具

本部分中，将待测标本（动物脾脏）制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，由气压装置送入流动室，以一定的流速经过喷嘴进入激光聚焦区，此时，在激光束的照射下，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模／数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来（如图1所示）。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征参数，从而可以对细胞进行分类，图2所示为激发光光源波长488nm为例的示意图。

图1流式细胞仪工作原理

图2激发光光源波长488nm为例的示意图

FCM在临床淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛应用，可同时检测出一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开，并计算出它们相互间的比例。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测，可了解在不同情况下机体的免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案。

由于FCM可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析，使FCM对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确，故其被认为是血液淋巴细胞亚群分析的可靠方法。

4、技术指标的选择

4.1实验动物的选择

本标准中推荐选用BALB/c小鼠作为试验动物。BALB/c品系为白化的近交系试验动物，广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究中。也可选择其他适宜的近交系试验动物。脾脏是小鼠的重要免疫器官，脾细胞是BALB/c进行小鼠免疫学功能研究的常用细胞。

4.2试验剂量的选择

为了充分反映材料的免疫原性，建议对材料进行梯度测试，即采用不同剂量组进行试验，以得出免疫应答的剂量-效应关系。

4.3淋巴细胞及其亚群分析

在临床上，淋巴细胞及其亚群分析项目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8;绝对计数;活化淋巴细胞的检测(CD69/HLA-R/CD71/B27);CD4+Th/i和CD8+Ts/c的进一步区分；Naive/Memory T细胞亚群的检测；Thl/Th2亚群的检测。

细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。通过这种光散射可对细胞进行大致的分类（见图3），但不能分析表面分子。而利用荧光标记的单克隆抗体染色进行多色分析，每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，选择不同的单抗及燃料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征；同时，FCM收集的荧光信号的强弱，还反映了细胞抗原的表达含量（图3血细胞的光散射分析见图4）。由此可见，使用FCM进行多参数细胞因子检测的最大优点在于：在其他细胞群体存在的情况下也可对特定细胞群体对特异性刺激的反应进行检测。因此应用FCM进行淋巴细胞及其亚群的检测对于临床疾病的诊断、探索疾病的发病机理具有极其重要的意义。

图3脾脏细胞的光散射分析