嘌呤受体P2Y_6在固有免疫中的功能及其机制研究

嘌呤受体P2Y_6在固有免疫中的功能及其机制研究

【摘要】：嘌呤受体P2Y6(purinergicreceptorP2Y,Gprotein-coupled,6)是P2Y受体家族中的一员,具有典型的7次跨膜结构,属G蛋白偶联受体家族成员。P2Y6受体在免疫器官、心血管系统、神经组织等多种器官和组织中表达,通过其选择性激动剂UDP(uridine5’-diphosphate)特异性激活PLC,上调细胞内Ca2+浓度,达到传递细胞间信号、调节细胞各种生理功能的目的。研究表明,P2Y6可以通过调节细胞因子IL-8表达促进炎症反应的发生；通过激活NF-κB促进破骨细胞的存活；同时还参与了单核细胞和T淋巴细胞的成熟和分化过程；另外,P2Y6还调节了血管炎症反应,参与心肌细胞纤维化过程,与心血管疾病的发生密切相关。随着研究的不断深入,P2Y6受体有望发展成为重要的药物靶点之一。然而P2Y6的调控功能和相应的分子机制仍有待进一步探索。巨噬细胞作为固有免疫系统中一种非常重要的效应细胞,广泛分布于身体各种组织,如表皮和黏膜组织,依靠细胞膜上或细胞膜内的模式识别受体PRRs(pattern-recognitionreceptors),如TLRs(Toll-likereceptors)、NLRs(NOD-likereceptors)和RLRs(RIG-I-likereceptors)等,快速识别病原体阻止感染；清除凋亡、突变和死亡细胞,在抵御外界病原体入侵、维护自身稳定和清除突变细胞中发挥重要作用。巨噬细胞可通过多种方式在固有免疫应答中发挥重要作用,主要表现为分泌细胞因子、招募免疫细胞、吞噬病原体并递呈抗原等功能。在我们前期的研究工作中,采用Q-PCR和

Westernblot等方法对嘌呤受体P2Y在巨噬细胞中的表达情况进行了分析,结果表明巨噬细胞广泛表达P2Y成员,其中P2Y6在巨噬细胞中呈现出高表达,提示P2Y6可能在巨噬细胞所介导的免疫功能中发挥重要作用。我们以小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠腹腔巨噬细胞为细胞模型,应用P2Y6受体选择性激动剂(UDP)和阻断剂(MRS2578),通过激活或阻断P2Y6受体相关信号通路,研究P2Y6在固有免疫应答中的调控作用及其分子机制。我们发现P2Y6能够促进巨噬细胞中细胞因子／趋化因子的转录表达,进而达到增强单核／巨噬细胞的趋化迁移作用。具体表现在：一、UDP激活P2Y6可以显著提高巨噬细胞中细胞因子／趋化因子的表达,如MCP-1,MIP-lα/β,IFN-α/β,TNF-α以及免疫共刺激分子CD80/86的转录表达；二、UDP刺激巨噬细胞后,其培养上清能明显引起单核细胞／巨噬细胞的趋化迁移,而这种作用能够被P2Y6选择性抑制剂MRS2578所抑制；三、UDP激活P2Y6后可以显著增强巨噬细胞RAW264.7的迁移能力。在此基础上,我们对P2Y6所参与调控巨噬细胞的信号通路进行了系统分析。Westernblot 结果显示P2Y6的激活能显著提高MEKl/2、PI3K、STAT1以及IRF3等的磷酸化水平,但对Src和IKK却没有明显作用；磷酸化MEKl/2明显激活ERKl/2通路,而P38及JNK没有显著性变化。应用MAPKs 信号通路的专一性抑制剂,如MEK1/2的U0126和PD9805,结合荧光素酶报告基因实验(Luciferaseassay)及EMSA技术,发现P2Y6主要通过激活MEKl/2-ERK1/2-AP1相关信号通路,从转录水平上调控了趋化因子MCP-1的表达。此外,P2Y6的激活通过提高IRF3和STAT1磷酸

化水平,显著性上调了Ⅰ型干扰素IFN-α/β等的转录表达,这些结果提示P2Y6受体在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。最后,我们通过MCP-1中和抗体实验和小鼠空气泡模型(Airpouchmodel),进一步确认了P2Y6通过上调趋化因子MCP-1的表达,进而在体内外调控单核／巨噬细胞招募的作用。同时,我们应用GFP标记的E.coil成功建立小鼠腹膜炎模型(Peritonitis),结果表明UDP通过激活P2Y6不仅可以提高局部感染组织对单核／巨噬细胞的招募,还能够显著增强小鼠清除病原体的能力,提高了小鼠的存活率。综上所述,嘌呤受体P2Y6能够通过MEKl/2-ERKl/2-AP1信号通路的激活,显著提高巨噬细胞中MCP-1等趋化因子的转录表达,在体内提高了单核／巨噬细胞的招募作用,最终达到增强机体抗感染能力,提高宿主存活的目的。本论文的研究为基于G蛋白偶联受体P2Y6的免疫调控药物的开发打下了良好的理论基础。【关键词】：P2Y_6巨噬细胞MCP-1趋化迁移腹膜炎模型

【学位授予单位】：华东师范大学

【学位级别】：博士

【学位授予年份】：2011

【分类号】：R392.1

【目录】：中文摘要6-8ABSTRACT8-12缩略词表12-14前言14-19

第一部分P2Y_6在巨噬细胞中的表达及其对固有免疫功能的影响19-41一、引言19-20二、材料与方法20-26三、结果26-37四、讨论37-41第二部分P2Y_6调控巨噬细胞的信号通路及其分子机制41-55一、引言41二、材料与方法41-44三、结果44-53四、讨论53-55第三部分P2Y_6通过招募单核/巨噬细胞增强宿主的抗细菌能力55-67一、引言55二、材料与方法55-57三、结果57-62四、讨论62-67全文结论67-68参考文献68-73综述嘌呤受体P2Y家族在免疫系统中功能研究进展73-98参考文献92-98附录98-101TableⅠ98-100TableⅡ100-101常规试剂配制方法101-105发表论文105-106致谢106-107 本论文购买请联系页眉网站。