实验一 人类基因组DNA的提取与鉴定_百替生物

2. 加入 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分钟, 除去 RNA (RNA 对 DNA 的操作、分析一般无影响，可省
略该步骤）。
3. 取 2μl DNA 样品在 0.8% Agarose 胶上电泳, 检测 DNA 的分子大小。同时取 15μl 稀释 20 倍, 测定
OD260/OD280, 检测 DNA 含量及质量。
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双链 DNA。如用 1cm 光径，用 H2O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 H2O 为空白对照，根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260 读数×稀释倍数/1000。
思考题： 1、 我们知道，一条染色体含有一条 DNA，基因组中不同的染色体 DNA 的大小是不同的。按理 来说，所提取的基因组 DNA 中含有多条大小不一的 DNA。但为什么用琼脂糖电泳后仅能见到 一条主带呢？ 2、 基因组 DNA 制备过程中提取缓冲液有哪些成分，作用是什么？ 3、 基因组 DNA 制备过程中需注意的事项有哪些？
实验一 人类基因组 DNA 的提取与鉴定
实验目的 1、学习人类基因组 DNA 的提取原理和方法。 2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。 实验原理
哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备 DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的
材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为
了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，
采取不同的材料处理方法，而后的 DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制
DNase 对 DNA 的降解；（2）尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏，保持 DNA 分子的完整；（3）将
蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。
分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 6．无水乙醇、75%乙醇, 灭菌双蒸水 ddH2O 7．RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 溶于 TE 配制：10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml
存的组织细胞中提取，常是采用在 EDTA 以及 SDS 等试剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽
提而实现的。这一方法获得的 DNA 不仅经酶切后可用于 Southern 分析，还可用于 PCR 的模板、文库
构建等实验。 一、材料
一份提取总 DNA 的细胞或组织 1.5ml Eppendorf 管、微量移液器与吸头、15ml 离心管、三角瓶（500 或 1000ml）。 二、设备 离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸 水浴、透射紫外灯。 三、试剂
扩展内容
植物基因组 DNA 的提取 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有 SDS 裂解细胞，使蛋白质变性
沉淀，用酚氯仿抽提除去蛋白，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀。 一、材料
鲜嫩的水稻幼苗或其它禾木科植物。 液氮，陶瓷研钵，50ml 离心管或 1.5ml 离心管，枪头，药勺。 二、设备 冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，移液器，电泳设备等。 三、试剂 1．提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0；5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS，1mol/Lβ-巯
Marmur 于 1961 年建立了用酚和氯仿从生物细胞中分离制备 DNA 的经典方法。但是此法的条件比
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较剧烈，还只能得到分子量为 5×106-5×107 道尔顿的 DNA 制品，从六十年代后半期开始，尤其是蛋白
1. 取 3-5 克嫩叶, 剪碎, 研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入 50m（l 1.5ml）离心管中，加入 20ml (1ml) 提
取缓冲液, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温 30-60 分钟 (时间长，DNA 产量高), 不时摇动。
2. 加入 5ml (150ul)5mol/L KAc, 颠倒混匀冰浴静置 20 分钟。
制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于
100-200kb。在 DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素，以保证 DNA 的完整性， 为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组 DNA 有 107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保
DNA 纯品的 OD260/OD280 为 1.8，故根据 OD260/OD280 的值可以估计 DNA 的纯度。若比值较高说明 含有 RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260 的比值应在 0.4-0.5 之间，若比值较高说明 有残余的盐存在。
用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或 TE 把提取的样品稀释 100 倍。将紫外分光光度计的波
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基乙醇。
2．RNase A 母液。
3．5mol/L KAc
4．其它试剂：酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，氯仿，异丙醇，TE 缓冲液，70%乙醇，灭菌双蒸水 ddH2O。 四、操作步骤：
（一）植物组织裂解液抽提
液、溴化乙锭（EB） 四、操作步骤（酚法抽提染色体 DNA） （一）DNA 的提取 1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将 唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm 离心 10 分钟，倒掉上清；重复 1 次。 2. 沉淀中加 1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加 350ml STE 和 150ml 10% SDS，摇匀，至出现粘 稠透明状。加 10ml 20mg/ml 蛋白酶 K，摇匀。37℃温箱过夜或 50℃ 3~4 小时。 3．加等体积饱和酚，轻摇混匀 10 分钟，室温 2000rpm 离心 10 分钟，去除蛋白和 SDS 的沉淀。 4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀 5 分钟，室温 2000rpm 离心 5 分钟。 5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。 6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向 DNA 溶液中加入 2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心 管混和至体系完全均一，见白色絮状 DNA。用移液器吸头挑出 DNA 沉淀，在新配制的 70%乙醇洗二 次，室温干燥 5 分钟，再将 DNA 溶于 20-100ml TE 中，测 OD 值。 7. TE 溶解的 DNA，在 4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加 2 倍体积无水乙醇置-70℃保存。 （二）DNA 的鉴定及定量 1. 比色法: DNA 在 260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在 280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集 中在 230nm 处。因此，可以用 260nm 波长进行分光测定 DNA 浓度，OD 值为 1 相当于大约 50μg/ml
五、注意事项
1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的 DNA 酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断 DNA 的可能性。
4. 用上述方法提取的 DNA 纯度可以满足一般实验（如 Southern 杂交、PCR 等）目的。如要求更高，
可参考有关资料进行 DNA 纯化。
3.
室温下 5000rpm 离心 20 分钟。
（二）植物基因组 DNA 纯化
1. 取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(在通风情况下操作)。待分层后，
12000rpm 离心 5 分钟。
2. 取上清液至干净离心管, 加等体积氯仿抽提(在通风情况下操作)，12000rpm 离心 5 分钟。
五、 注意事项
1. 酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量 STE 稀释，然后再用酚抽提。
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2. 保温可在 45~55℃范围内进行。 3. 真核生物的 DNA 分子很大，机械张力极易引起 DNA 分子的断裂，因此抽提 DNA 时动作不可过 猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴管， 以防机械力（震动）将 DNA 分子 打得太碎。 4. 沉淀 DNA 时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。 5. DNA 溶于 TE 溶液时可先浓一点，发现太浓时再加些 TE 溶液。这样能保证 DNA 样品不至于太稀 而无法使用，一般来讲，DNA 浓度为 0.4~0.6mg/ml 最为理想。 6. 溶于 TE 溶液中的 DNA 样品比较稳定，可在 4℃冰箱中存放 1 年而不会降解。
酶 K 的发现，大大促进了真核生物细胞中分离提取高分子量 DNA 的研究。在 SDS 和 EDTA 的存在下，蛋
白酶 K 仍具有很高的活力，因而可在抑制 DNA 降解酶活力的条件下用蛋白酶 K 消化去除蛋白质，为制
备高纯度、高分子量的 DNA 制品创造条件。
附录 2 试剂准备 1．STE 裂解液：2.5M NaCl 4ml，2M Tris-HCl (pH 8.0) 0.5ml，500mM EDTA (pH 8.0) 0.2ml，加水定容
3. 仔细移取上清液至另一 50ml（1.5ml）离心管，加入 1 倍体积预冷的异丙醇，混匀，室温下放置片
刻即出现絮状 DNA 沉淀。
4. 12000rpm 离心 5 分钟，获得沉淀后，用 70％酒精洗涤 2-3 次，风干沉淀。
（三）植物基因组 DNA 的溶解、检测和保存
1. 在 1.5ml eppendorf 中加入 1ml (100ul) TE。DNA 很快溶解于 TE。
至 100ml。 2．酶解液：200mM NaCl，20mM Tris-HCl (pH 7.4)；50mM EDTA (pH 8.0)，1.5％SDS。 3．蛋白酶 K：10mg/ml 配好后用一次性滤膜过滤，-20℃保存。 4．氯仿：异戊醇=24∶1 5．Tris 饱和酚（pH 8.0）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的
长设为 260nm，以重蒸水或 TE 做为对照，测定 OD 值。
OD260=
；
DNA 的浓度=50 OD260 稀释倍数=
。
将波长换成 280nm 及 230nm，用同一样品再次测定 OD 值：
OD280=
；OD230=
；
OD260/OD280 =
；OD260/OD230=
；
结论：所提取的 DNA
。
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1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA 2．0.8%（W/V）标准琼脂糖； 3．0.5×TBE 缓冲液 4．其他试剂：TE 缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲
2. 电泳鉴定 取样品 1μl、电泳缓冲液 5μl、6×加样缓冲液 1μl（含溴酚蓝和二甲苯青 FF 指示剂及甘油），混匀，
在 0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体 λDNA 作为标准。DNA 区带应比较集中，泳动 速度与 λDNA 相同或稍慢，证明分子量均 >50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的 RNA 区带。如 果 DNA 不成区带，而是散开分布在 λDNA 与溴酚蓝之间，则说明 DNA 已经被降解成小分子，不能再 用来进行限制性内切酶图谱分析。
附录 1 DNA 提取史中的重要事件
Fricdrich Miescher(1844-1894),瑞士生理学家，有机化学家。1868 年医学院毕业后，在著名的
有机化学家 Hoppe-Seyle 的实验室以浓细胞为材料，研究淋巴细胞的组成。1869 年，他从浓细胞的细
胞核中分离出含有大量磷的“核素”，核素即是 DNA。这是人类第一次提取的 DNA。