实验一 人类基因组DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。
2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。
3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。
二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
dna提取及测定实验报告
dna提取及测定实验报告DNA 提取及测定实验报告一、实验目的1、掌握从生物样本中提取 DNA 的基本原理和方法。
2、学习使用分光光度计测定 DNA 浓度和纯度。
3、培养实验操作能力和科学思维。
二、实验原理DNA 是遗传信息的携带者，存在于细胞核和细胞器中。
提取 DNA 的基本原理是利用细胞裂解液破坏细胞膜和核膜，使 DNA 释放出来，然后通过一系列的物理和化学方法去除蛋白质、RNA 等杂质，从而获得纯净的 DNA 。
常用的 DNA 提取方法有酚氯仿抽提法、盐析法、试剂盒法等。
本实验采用试剂盒法提取 DNA ，其原理是利用硅胶膜在高盐环境下特异性吸附 DNA ，而在低盐环境下 DNA 被洗脱下来。
分光光度计测定 DNA 浓度和纯度的原理是 DNA 在 260nm 处有特征吸收峰，其吸光度与 DNA 浓度成正比。
同时，DNA 在 280nm 处也有吸收峰，通过计算 A260/A280 的比值，可以评估 DNA 的纯度。
纯DNA 的 A260/A280 比值约为 18 。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的动物肝脏组织DNA 提取试剂盒无水乙醇双蒸水2、实验仪器离心机移液器恒温培养箱分光光度计四、实验步骤1、样本处理称取约 01g 新鲜的动物肝脏组织，放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末状。
将研磨好的组织粉末转移至 15ml 离心管中，加入200μl 裂解液，充分混匀，室温放置 5min ，使细胞充分裂解。
2、 DNA 提取向裂解液中加入200μl 无水乙醇，充分混匀。
将混合液转移至吸附柱中，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。
向吸附柱中加入500μl 洗涤液 1 ，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。
向吸附柱中加入500μl 洗涤液 2 ，12000rpm 离心 1min ，弃去滤液。
再次 12000rpm 离心 2min ，以去除残留的洗涤液。
将吸附柱转移至新的 15ml 离心管中，向吸附膜中央加入50μl 洗脱液，室温放置 2min ，12000rpm 离心 1min ，收集洗脱液，即为提取的DNA 。
定量蛋白组学-百替生物
分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等
结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；
自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。由于使用的15N培养基纯度>96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。
优点：
缺点：
即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)
割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。
SILAC相对于iCAT有着更高的精确性，而且不需要复杂的化学过程和纯化步骤保证了样品相似的实验条件。
01
然而，SILAC不能用于临床的组织和血液标本。
02
新的生物标记的发现将帮助我们更好地弄清疾病致病机制和预后，用于提高早期诊断的敏感性，找到治疗靶点，弄清药物治疗作用的机制。利用上述定量蛋白组学技术精确定量正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平，进而找出二者的差异，筛选得到与疾病密切相关的差异蛋白，进而确定靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。
3
信号强度法：根据一级质谱相关的肽段峰强度（Mass spectral peak intensity）、峰面积（Peak area）、液相色谱保留时间（LC retention time）等信息进行定量分析；
高二生物dna的粗提取与鉴定
用纱布过滤，取其滤液，DNA溶于滤液中
8、提取含杂质较少的DNA
在溶液中加入冷却的酒精溶液50ml，溶液中出现 杂质较少的丝状物，它的主要成分就是DNA。
9、DNA的鉴定
用二苯胺（沸水浴）鉴定，DNA遇二苯 胺会变蓝色。
问：2和4过程中都有加入蒸馏水，两次加入的 作用一样吗？为什么？
问：DNA的直径约为2nm，实验中出现的丝状 物的粗细是否就表示一个DNA分子直径的大小？
练习：
1、用蛋白质中含有35S的噬菌体去侵染细菌（细菌 内为32S），则在子代噬菌体的蛋白质的S应为 （）
A35S
B32S
C35S和32S
D35S或32S
2、用噬菌体去感染体内含32P的细菌，在细菌解体 后，含32P的应是（ ）
美丽无忧网/
彩的眼睛喷出浓绿色的飘飘阴气……特像两排闸门一样的牙齿透出浓黑色的点点神香……最后旋起圆圆的的脖子一扭，猛然从里面射出一道玉光，她抓住玉光绝妙地一转，一件黄澄澄、亮晶晶的 咒符¤雨光牧童谣→便显露出来，只见这个这件怪物儿，一边膨胀，一边发出“吱吱”的异音……！猛然间壮扭公主疯妖般地念起咿咿呀呀的宇宙语，只见她圆润光滑的下巴中，飘然射出五十团 摇舞着¤巨力碎天指→的火花状的漏斗，随着壮扭公主的甩动，火花状的漏斗像怪藤一样在双肩上残暴地设计出飘飘光环……紧接着壮扭公主又连续使出三十六式七鹰谷穗钻，只见她明朗奔放极 像菊黄色连体降落伞一样的胸罩中，狂傲地流出四十串摆舞着¤巨力碎天指→的磁盘状的牙齿，随着壮扭公主的摆动，磁盘状的牙齿像驴球一样念动咒语：“原野哄哩喂，肥妹哄哩喂，原野肥妹 哄哩喂……¤雨光牧童谣→！老母！老母！老母！”只见壮扭公主的身影射出一片青古磁色幽光，这时西南方向突然出现了五片厉声尖叫的紫罗兰色光蟒，似银光一样直奔湖青色粼光而去。，朝 着女伤兵罗雯依琦妖女深白色火球一般的牙齿乱晃过去。紧跟着壮扭公主也狂耍着咒符像缰绳般的怪影一样向女伤兵罗雯依琦妖女乱晃过去随着两条怪异光影的瞬间碰撞，半空顿时出现一道金橙 色的闪光，地面变成了土黄色、景物变成了海蓝色、天空变成了春绿色、四周发出了深邃的巨响！壮扭公主齐整严密的牙齿受到震颤，但精神感觉很爽！再看女伤兵罗雯依琦妖女细长的暗黑色娃 娃一样的胸部，此时正惨碎成海马样的暗白色飞丝，快速射向远方，女伤兵罗雯依琦妖女怪嚷着狂鬼般地跳出界外，急速将细长的暗黑色娃娃一样的胸部复原，但元气已损失不少神圣壮扭公主： “老魔头，太垃圾！你的魔术水平好像很有创新性哦……女伤兵罗雯依琦妖女：“我再让你领会领会什么是威猛派！什么是怪异流！什么是暴力怪异风格！”壮扭公主：“您要是没什么新本事， 我可不想哄你玩喽！”女伤兵罗雯依琦妖女：“你敢小瞧我，我再让你尝尝『红丝秋神灯笼剑』的风采！”女伤兵罗雯依琦妖女超然威风的深灰色怪藤样的嘴唇连续膨胀疯耍起来……亮紫色旗杆 一样的眉毛透出纯黄色的阵阵春雾……纯灰色蛤蟆一般的脸闪出亮灰色的隐约幽音。接着把轻盈的手指甩了甩，只见七道闪烁的活似镊子般的彩烟，突然从轻灵的紫玫瑰色鳄鱼模样的鼻子中飞出 ，随着一声低沉古怪的轰响，亮紫色的大地开始抖动摇晃起来，一种怪怪的明静彩光味在强悍的空气中飞舞……紧接着扭动粗俗的脖子一吼，露出一副古怪的神色，接着晃动肥壮噬菌体DNA
1-1人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析
室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
11.取5 -10μl基因组DNA，并加入2 μl上样缓冲液，混匀，加样到1％琼脂糖凝胶 点样孔中，电泳检测分析。
15
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第六节
注意事项
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第七节
LIFE LOGO
结果分析
M
1
2
3
4
5
21226 bp
M: λDNA/HindIII+EcoRI DNA Marker； 1-5: 基因组DNA 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图
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课程相关资源
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10
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第四节
主要仪器
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主要仪器
LIFE
微量移液器
台式微量离心机
凝胶成像系统
电泳仪
12
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第五节
操作步骤
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本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从 DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。
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第一节
实验原理
高盐，低pH值： 选择性结合 DNA
漂洗
低盐，高pH值： DNA从硅基质膜上洗脱
基因的转移与重组体的筛选和鉴定_百替生物
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的CaCl2（50～100mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
人类基因组dna的提取实验报告
人类基因组dna的提取实验报告
人类基因组DNA的提取实验报告
DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础性技术之一。
本次实验旨在从人类细胞中提取DNA，并通过多种方法进行检测和分析。
以下是实验的详细过程和结果。
实验材料与方法：
1.材料：人类细胞样本、细胞裂解液、蛋白酶K、异丙醇、氯仿、等渗盐溶液、乙醇、TE缓冲液、琼脂糖、DNA标准品。
2.方法：
（1）取100μl人类细胞样本，加入细胞裂解液中进行细胞破裂。
（2）加入蛋白酶K使细胞膜和蛋白质降解。
（3）加入异丙醇使DNA沉淀，离心去除上层液体。
（4）加入氯仿和等渗盐溶液，离心分离DNA纯化。
（5）加入乙醇沉淀DNA。
（6）加入TE缓冲液重溶DNA。
（7）用琼脂糖凝胶电泳法分离DNA并检测。
实验结果：
经过琼脂糖凝胶电泳分离，成功提取了人类细胞的DNA样本。
在电泳结果中，能够明显地看到DNA条带的形成，表明DNA的提取和纯化过程都比较成功。
为了进一步检测DNA的纯度和浓度，我们使用了多种方法，如吸光度测定、荧光染料检测等。
实验结果表明，提取出的DNA纯度较高，浓度也较为理想。
结论：
通过本次实验，我们成功地提取了人类细胞的DNA，并对其进行了检测和分析。
这为我们后续的研究提供了重要的基础。
同时，实验还说明了DNA提取技术的重要性和应用广泛性，不仅在分子生物学和遗传学领域有着广泛的应用，也在医学和生物工程等领域具有重要的价值。
实验——DNA的粗提取与鉴定#优选.
实验DNA的粗提取与鉴定目的要求1.了解实验原理。
2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。
3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。
实验原理1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。
当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。
利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。
利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
注意事项1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。
2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。
实验用具鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0．1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0．015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。
课时安排一课时课前准备制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。
静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。
（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。
用吸管吸去上清液。
板书（提前写好）DNA的粗提取与鉴定实验原理：1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA。
2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA。
3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。
方法步骤：1．提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。
DNA提取ppt
加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电 源，开始电泳。 样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之
间距离比)。当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。
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DNA的琼脂糖凝胶电泳
5、染色
将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中，室温 下浸泡染色30min。
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人类基因组DNA提取
试剂 1.5ml Eppend orf管、微量移液器 与吸头、15ml离心 管、三角瓶（500或 1000ml）。
离心机、电子天平、 恒温水浴箱、紫外分 光光度计、电泳仪、 电泳槽、凝胶成像仪 、微波炉或沸水浴、 透射紫外灯
特别注意： 溴化乙锭是DNA诱变剂和致癌物质，配制和使 用EB染色液时，应戴乳胶手套，不要将该溶液洒 在桌面或地面上。凡是沾污过溴化乙锭的器皿， 必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。
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DNA的琼脂糖凝胶电泳
6、观察
小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴 化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外 灯下进行观察。 DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的 条带。
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与其他方法的比较 方法分别用淋巴细胞分离液、红细胞裂解液处理 全血样本,用经典酚醇法、盐析法、碘化钾法、煮 沸法提取DNA,比较这些方法所获得的DNA模板对 PCR法检测HLA的影响,并进行了标本放置不同时 间对DNA抽提结果的影响的实验.结果在所比较的 几种方法中,经典酚醇法、盐析法、碘化钾法提取 的DNA有较高的纯度和浓度,以其为模扳所进行的 PCR结果较好,其中以碘化钾法的操作最为简便可 靠.结论常规抽提DNA以碘化钾法最为适用,一月 内4.C放置全血标本对人类基因组DNA抽提结果 无明显影响.
遗传学实验报告：人类基因组DNA的提取及SBMA基因的诊断
人类基因组DNA的提取及SBMA基因的诊断一、实验目的初步了解人基因组DNA提取方法，掌握人类基因组DNA在遗传病的分子诊断中的应用。
初步掌握分子诊断中常用的分子生物学技术，初步掌握动态突变导致人类遗传病的基因诊断分析方法。
二、实验原理1.人类基因组DNA的提取采用非酶法提取基因组DNA。
非酶法提取基因组DNA是应用饱和氧化钠溶液通过脱水和沉淀作用将细跑中蛋白析出，同时利用SDS结合蛋白质，从而将基因组DNA提取出来。
这种方法不需要使用蛋白酶K和其他的有机溶剂，大大降低了对操作者的危害。
2.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
3.SBNA基因的诊断脊髓延髓肌萎缩症（SBMA，Spinal and Bulbar Muscular Atrophy），别称为X-连锁脊髓延髓肌萎缩症，又称Kennedy病（肯尼迪氏症），是一种迟发的X-连锁隐性遗传性神经系统变性疾病，属三核苷酸重复扩增的神经变性病，主要累及下运动神经元、感觉系统和内分泌系统。
质粒DNA提取_百替生物
一、材料为了方便起见，我们注明了本室所用培养基、试剂及在附录6.6仪器的型号和来源，供读者参考。
(一)仪器(见附录6．6)(二)器皿(见附录6．6)(三)菌种大肠杆菌K-12HBl0l(pBR322)(四)培养基1.LB液体培养基：(0．5％)1.5克精解蛋白胨(上海禽蛋二厂，生化试剂或日本po1ypepton，下同)。
(1％)3克，酵母浸出粉(上海酵母厂，生化试剂或Oxoid英国或difCo美国，下同)。
(0.5%)1．5克，氯化钠(上海南汇彭镇营房化工厂，分子量58．44，分析纯，下同)。
(1％)3克葡萄糖(上海化学试剂采购供应站，分子量198．17，分析纯，下同)。
按上述配方用重蒸水(以ddH20表示，下同)溶解至300毫升。
用10mol/LNa0H调pH至7．2－7．4。
分装于150毫升三角烧瓶中，每瓶30毫升。
然后置高压蒸汽锅以10342l.4帕(15磅／时2)，灭菌20分钟。
2．M9液体培养基A液：NaHPO4.2H2O(上海化学试剂二厂，分子量178．05，分析纯)12克KH2PO4(上海化学试剂二厂，分子量136．08，分析纯6克NH4Cl(上海无机化工研究所，分子量53．49，分析纯2克NaCl1克蛋白胨10克重蒸水定容至1800毫升按上述配方配制A液1800毫升，分装于500毫升三角烧瓶中，每瓶180毫升。
B液：MgSO4.7H20(上海金山尖塔化工厂，分子量303．30，分析纯，下同)0.26克葡萄糖8克重蒸水定容至200毫升按上述配方配制B液，分装于100毫升/250毫升三角瓶，共2只。
将A液与B液置高压蒸汽消毒锅中，以55158.08帕(8磅／时2)，灭菌30分钟。
接种前，在无菌室内用灭菌移液管吸20毫升B液加入180毫升/500毫升三角瓶的A液中，即成200毫升的M9液体培养基。
3.抗菌素：氨苄青霉素（Amp）临用时无菌水配制在灭菌有盖试管中，母液浓度为100毫克/毫升。
实验一 哺乳动物基因组DNA的提取_百替生物
1．所有用品均需要高温高压，以灭活残余的 DNA 酶。 2．所有试剂均用高压灭菌双蒸水配置。 3．用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断 DNA 的可能性。 4．用上述方法提取的 DNA 纯度可以满足一般实验（如 Southern 杂交、PCR 等）目的。如要求更高， 可参考有关资料进行 DNA 纯化。
作业与思考
如果 RNA 降解了，在快速电泳时会出现什么样的电泳图像？
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2. 加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s，静置 2min。 3. 4℃离心，12000g×15min，取上清置另一 1.5ml 离心管中。 4. 加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min。 5. 4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6. 加入 1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的 DEPC H2O 溶解（65℃促溶 10～15min）。 8. 快速电泳检测 RNA 完整性。
实验原理
PCR 反应的基本成分包括：模板 DNA(待扩增 DNA)、引物、4 种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA 聚合酶 和适宜的缓冲液。类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA 的高温变性：模板 DNA 经加热至 93℃左 右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结 合，为下轮反应作准备；②模板 DNA 与引物的低温退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度 降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA 模板--引物结合 物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
人类基因组DNA提取
实验步骤
常温下，将上清转移至含有3ml无水乙醇的 离心管中。 轻轻摇晃，可能看到絮状DNA沉淀物。 2900rpm离心3min，如果仍见悬浮物则可 轻柔摇晃2min，再离心3min。 弃上清，用5ml 70% 乙醇洗涤沉淀1次。 弃上清，自然风干DNA 5-10min。 加入30-50ul TE 至离心管中，溶解DNA。
实验一 人类基因组DNA提取
医学遗传系
实验目的
初步了解人类基因组DNA提取方法 为遗传病的分子诊断提供材料
实验原理
采用非酶法提取基因组DNA
应用饱和氯化钠溶液通过脱水和沉淀作用 将细胞中蛋白质析出。 不需要使用蛋白酶K和其他有机溶剂，大大 பைடு நூலகம்低了多操作者的危害。 从3ml血样中可以获得50-150mgDNA，具有 较高的经济效用。
常用DNA提取方法
酚、氯仿萃取法 酶学法 饱和盐析法
基因组DNA来源
• 外周血 • 组织
– 绒毛 – 毛囊 – 身体组织
• 血斑 • 单独细胞
实验步骤
漱口后，用压舌板 在口腔轻刮几下， 用2ml生理盐水冲 洗压舌板；同时收 集唾液2ml，放在 同一5ml离心管中。
实验步骤
实验步骤
离心5min （2500rpm）
弃上清，留沉淀，再 加入生理盐水至5ml， 重复离心。
弃上清，留沉淀。用 4ml TKM1 轻轻吹打 沉淀细胞。
实验步骤
常温下，2900rpm离心5min 弃上清，留沉淀。加入0.8ml TKM2。 轻柔吹打至沉淀溶解。 加入70ul 10% SDS。 65摄氏度45min至沉淀溶解，期间轻柔吹打。 加入300ul 6M NaCl，轻柔混匀。 2900rpm离心3min
基因组DNA的提取及实验方法
二、黑芝麻色素的体外抗氧化作用评价：
1、铁离子还原能力（总抗氧化能力）：
FRAP值（mmol/g）
20
15
10
5 0.67
0 黑芝麻
7.41 BHT
17.66 BHA
8.75 Vc
图一 黑芝麻总抗氧化能力与常用抗氧化剂 BHT、BHA、Vc 的比较
DNA 纯化：加入适量 10mg/ml RNase，置 37 oC 30min，充分降解 RNA。 再用氯仿-异戊醇抽提一次，DNA 沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量 DNA 稀释液与标准浓 度 λDNA 同时在 1%琼脂糖凝胶电泳上进行 DNA 定量并检查 DNA 质量。
附：（1）DNA 提取液（1000ml）
PCR 扩增条件
94℃ 94℃ X（按所用引物确定退火温度） 72℃ 72℃ 4℃
3 min 30 s 50 s 1 min 10 min 保存
35 cycles
PCR 扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液 2l，混匀，取 4l PCR 扩增产物用 1％ 琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为 120V，电泳 1h 左右，UV 检测扩增产物的多态 性。
PCR 反应在 10l 体系中 模板（基因组 DNA） Primer (R)
1l（10ng/l） 0.2l（10M）
Primer (F) 10×buffer dNTP (2.5mM) MgCl2 (25mM) Taq 酶 ddH2OH2O 总体积
0.2l（10M） 1l 0.8l 0.8l 0.1l (0.5U) 5.9l 10l
保持 4℃下混匀；转移至 1.5ml 离心管中，4℃ 15000rpm 低温离心 15min；将上清液转入另 一离心管中，向管中加 4 体积的 10%TCA 溶液(10%三氯乙酸中加入 0.02% β-巯基乙醇，v/v)， 混匀，-20℃静置 1~2h（或过夜，期间间歇一定时间振荡一次）；15000rpm 离心 15min，弃上 清液，沉淀用 80%冷丙酮洗涤三次，最后用冷丙酮-乙醚液（体积 1:1）洗涤，沉淀经真空干 燥得到粉末状蛋白，-80℃冰箱保存备用。
人类基因组DNA的提取与鉴定
人类基因组DNA的提取与鉴定实验一人类基因组DNA的提取与鉴定实验目的1、学习人类基因组DNA的提取原理和方法。
2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。
实验原理哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。
原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
一、材料一份提取总DNA的细胞或组织1.5ml Eppendorf管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml）。
二、设备离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。
三、试剂1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA2．0.8%（W/V）标准琼脂糖；3．0.5×TBE缓冲液4．其他试剂：TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB）四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）（一）DNA的提取1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。
生物实验报告单含答案
实验名称：DNA提取与鉴定实验日期：2023年3月15日实验者：张三实验目的：1. 学习DNA提取的基本原理和操作步骤。
2. 掌握DNA纯化、定量和鉴定方法。
3. 了解DNA在生物科学研究中的应用。
实验原理：DNA是生物体内携带遗传信息的分子，存在于细胞核、线粒体和叶绿体中。
DNA提取是分子生物学研究中的重要技术之一，用于获取纯化的DNA样品，为后续实验提供材料。
本实验采用苯酚/氯仿法提取DNA，并通过紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度。
实验材料：1. 人发样本2. 10×TE缓冲液3. 5M NaCl溶液4. 95%乙醇5. 70%乙醇6. 1×TAE缓冲液7. 1%琼脂糖凝胶8. 紫外分光光度计9. 离心机10. 电泳仪实验步骤：1. 将人发样本剪成小段，用剪刀剪碎，置于研钵中。
2. 向研钵中加入1ml 10×TE缓冲液，研磨至无颗粒状物质。
3. 将研磨好的样本转移至离心管中，加入2ml苯酚/氯仿溶液，剧烈振荡5分钟。
4. 12,000rpm离心15分钟，将上清液转移至新的离心管中。
5. 向上清液中加入等体积的95%乙醇，混匀，静置10分钟。
6. 12,000rpm离心10分钟，弃去上清液。
7. 用70%乙醇洗涤沉淀物，12,000rpm离心5分钟，弃去上清液。
8. 将沉淀物溶于100μl 5M NaCl溶液中，用紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。
9. 将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
实验结果：1. DNA浓度：50ng/μl2. DNA纯度：A260/A280=1.83. 琼脂糖凝胶电泳结果：DNA条带清晰，与Marker位置一致。
实验讨论：1. 本实验成功提取了人发样本中的DNA，表明实验操作正确。
2. DNA纯度较高，说明提取过程中杂质较少。
3. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，DNA分子量与Marker一致，进一步证实了提取的DNA纯度较高。
实验结论：本实验成功提取了人发样本中的DNA，并通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳对DNA进行了鉴定。
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白酶 K 仍具有很高的活力，因而可在抑制 DNA 降解酶活力的条件下用蛋白酶 K 消化去除蛋白质，为制
备高纯度、高分子量的 DNA 制品创造条件。
附录 2 试剂准备 1．STE 裂解液：2.5M NaCl 4ml，2M Tris-HCl (pH 8.0) 0.5ml，500mM EDTA (pH 8.0) 0.2ml，加水定容
存的组织细胞中提取，常是采用在 EDTA 以及 SDS 等试剂存在下用蛋白酶 K 消化细胞，随后用酚抽
提而实现的。这一方法获得的 DNA 不仅经酶切后可用于 South份提取总 DNA 的细胞或组织 1.5ml Eppendorf 管、微量移液器与吸头、15ml 离心管、三角瓶（500 或 1000ml）。 二、设备 离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸 水浴、透射紫外灯。 三、试剂
3. 仔细移取上清液至另一 50ml（1.5ml）离心管，加入 1 倍体积预冷的异丙醇，混匀，室温下放置片
刻即出现絮状 DNA 沉淀。
4. 12000rpm 离心 5 分钟，获得沉淀后，用 70％酒精洗涤 2-3 次，风干沉淀。
（三）植物基因组 DNA 的溶解、检测和保存
1. 在 1.5ml eppendorf 中加入 1ml (100ul) TE。DNA 很快溶解于 TE。
了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，
采取不同的材料处理方法，而后的 DNA 提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制
DNase 对 DNA 的降解；（2）尽量减少对溶液中 DNA 的机械剪切破坏，保持 DNA 分子的完整；（3）将
蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。
五、 注意事项
1. 酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量 STE 稀释，然后再用酚抽提。
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2. 保温可在 45~55℃范围内进行。 3. 真核生物的 DNA 分子很大，机械张力极易引起 DNA 分子的断裂，因此抽提 DNA 时动作不可过 猛；溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗口径滴管， 以防机械力（震动）将 DNA 分子 打得太碎。 4. 沉淀 DNA 时要小心操作，勿使纤维网断成小丝。 5. DNA 溶于 TE 溶液时可先浓一点，发现太浓时再加些 TE 溶液。这样能保证 DNA 样品不至于太稀 而无法使用，一般来讲，DNA 浓度为 0.4~0.6mg/ml 最为理想。 6. 溶于 TE 溶液中的 DNA 样品比较稳定，可在 4℃冰箱中存放 1 年而不会降解。
实验一 人类基因组 DNA 的提取与鉴定
实验目的 1、学习人类基因组 DNA 的提取原理和方法。 2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。 实验原理
哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备 DNA，除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的
材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为
扩展内容
植物基因组 DNA 的提取 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有 SDS 裂解细胞，使蛋白质变性
沉淀，用酚氯仿抽提除去蛋白，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀。 一、材料
鲜嫩的水稻幼苗或其它禾木科植物。 液氮，陶瓷研钵，50ml 离心管或 1.5ml 离心管，枪头，药勺。 二、设备 冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，移液器，电泳设备等。 三、试剂 1．提取缓冲液：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0；5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS，1mol/Lβ-巯
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双链 DNA。如用 1cm 光径，用 H2O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 H2O 为空白对照，根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260 读数×稀释倍数/1000。
分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 6．无水乙醇、75%乙醇, 灭菌双蒸水 ddH2O 7．RNA 酶 A 母液：将 RNA 酶 溶于 TE 配制：10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml
3.
室温下 5000rpm 离心 20 分钟。
（二）植物基因组 DNA 纯化
1. 取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(在通风情况下操作)。待分层后，
12000rpm 离心 5 分钟。
2. 取上清液至干净离心管, 加等体积氯仿抽提(在通风情况下操作)，12000rpm 离心 5 分钟。
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1．细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA 2．0.8%（W/V）标准琼脂糖； 3．0.5×TBE 缓冲液 4．其他试剂：TE 缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲
思考题： 1、 我们知道，一条染色体含有一条 DNA，基因组中不同的染色体 DNA 的大小是不同的。按理 来说，所提取的基因组 DNA 中含有多条大小不一的 DNA。但为什么用琼脂糖电泳后仅能见到 一条主带呢？ 2、 基因组 DNA 制备过程中提取缓冲液有哪些成分，作用是什么？ 3、 基因组 DNA 制备过程中需注意的事项有哪些？
长设为 260nm，以重蒸水或 TE 做为对照，测定 OD 值。
OD260=
；
DNA 的浓度=50 OD260 稀释倍数=
。
将波长换成 280nm 及 230nm，用同一样品再次测定 OD 值：
OD280=
；OD230=
；
OD260/OD280 =
；OD260/OD230=
；
结论：所提取的 DNA
。
1. 取 3-5 克嫩叶, 剪碎, 研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入 50m（l 1.5ml）离心管中，加入 20ml (1ml) 提
取缓冲液, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温 30-60 分钟 (时间长，DNA 产量高), 不时摇动。
2. 加入 5ml (150ul)5mol/L KAc, 颠倒混匀冰浴静置 20 分钟。
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基乙醇。
2．RNase A 母液。
3．5mol/L KAc
4．其它试剂：酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，氯仿，异丙醇，TE 缓冲液，70%乙醇，灭菌双蒸水 ddH2O。 四、操作步骤：
（一）植物组织裂解液抽提
至 100ml。 2．酶解液：200mM NaCl，20mM Tris-HCl (pH 7.4)；50mM EDTA (pH 8.0)，1.5％SDS。 3．蛋白酶 K：10mg/ml 配好后用一次性滤膜过滤，-20℃保存。 4．氯仿：异戊醇=24∶1 5．Tris 饱和酚（pH 8.0）酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的
Marmur 于 1961 年建立了用酚和氯仿从生物细胞中分离制备 DNA 的经典方法。但是此法的条件比
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较剧烈，还只能得到分子量为 5×106-5×107 道尔顿的 DNA 制品，从六十年代后半期开始，尤其是蛋白
制备基因组 DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于
100-200kb。在 DNA 提取过程中应尽量避免使 DNA 断裂和降解的各种因素，以保证 DNA 的完整性， 为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组 DNA 有 107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保
DNA 纯品的 OD260/OD280 为 1.8，故根据 OD260/OD280 的值可以估计 DNA 的纯度。若比值较高说明 含有 RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260 的比值应在 0.4-0.5 之间，若比值较高说明 有残余的盐存在。
用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或 TE 把提取的样品稀释 100 倍。将紫外分光光度计的波
液、溴化乙锭（EB） 四、操作步骤（酚法抽提染色体 DNA） （一）DNA 的提取 1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将 唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm 离心 10 分钟，倒掉上清；重复 1 次。 2. 沉淀中加 1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加 350ml STE 和 150ml 10% SDS，摇匀，至出现粘 稠透明状。加 10ml 20mg/ml 蛋白酶 K，摇匀。37℃温箱过夜或 50℃ 3~4 小时。 3．加等体积饱和酚，轻摇混匀 10 分钟，室温 2000rpm 离心 10 分钟，去除蛋白和 SDS 的沉淀。 4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀 5 分钟，室温 2000rpm 离心 5 分钟。 5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。 6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向 DNA 溶液中加入 2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心 管混和至体系完全均一，见白色絮状 DNA。用移液器吸头挑出 DNA 沉淀，在新配制的 70%乙醇洗二 次，室温干燥 5 分钟，再将 DNA 溶于 20-100ml TE 中，测 OD 值。 7. TE 溶解的 DNA，在 4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加 2 倍体积无水乙醇置-70℃保存。 （二）DNA 的鉴定及定量 1. 比色法: DNA 在 260nm 处有最大的吸收峰，蛋白质在 280nm 处有最大的吸收峰，盐和小分子则集 中在 230nm 处。因此，可以用 260nm 波长进行分光测定 DNA 浓度，OD 值为 1 相当于大约 50μg/ml