常用分子生物学技术原理及应用
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将在凝胶中分离的生物大分子转移 （印迹）或直接放在固定化介质上并 加以检测分析的技术。
电转移印迹技术、真空吸引转移印迹
广泛应用于DNA、RNA、 蛋白质检测
印迹技术的分类及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒 和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。 靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
蛋白质免疫印迹法
• 实验操作 1 细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的SDS-PAGE； 4 蛋白质的转移； 6 目的蛋白质的检测。
蛋白质免疫印迹法
第二十一章
常用分子生物学技 术的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
生物化学教研室
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
核酸分子杂交 (hybridization)
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
复性
RNA
DNA
1. 原理 变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
Fra Baidu bibliotek
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度
对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm 处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。
蛋白质免疫印迹法
• 免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 • 测定相对含量时，需要内参照 • 选择合适的反应条件：SDS-PAGE胶浓度；
转移膜的选择；转移时间的选择 • 注意电极的正负极 • 抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡 • 操作要轻柔。
三
种
印
迹
12月24日上午9：00
技
术
的
比
较
②
③ ①
分子杂交实验
退火(annealing):
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性
复性条件：Tm －250C 4度以下几乎不复性
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在 DNA 复 性 过 程 中 ， 如 果 把 不 同 DNA 单 链 分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA 放 在 一 起 ， 只 要 在 DNA或 RNA的单链分子之间有一定的碱基配对 关系，就可以在不同的分子之间形成杂 化双链(heteroduplex) 。
➢ Tm：
➢其大小与G+C含量成正比。
(melting temperature)
变性是在一个 相当窄的温度范 围内完成，在这 一范围内，紫外 光吸收值达到最 大值的50%时的 温度称为DNA的 解链温度，又称 融解温度。
DNA的复性 复性(renaturation):
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢 复天然的双螺旋构象。
放 射 自 显 影 照 片
DNA 点阵
本节要点
1、印迹技术的分类
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
从组织或细胞中提取基因组DNA→限制性 内切酶消化→琼脂糖凝胶电泳将DNA按大小分 离→含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性→ DNA 变性后从凝胶转移到固相支持物上→特 异性探针与固着于膜上的DNA杂交→杂交结果
反映待测核酸样品的有关基因信息。
限制性酶切割
DNA分子
限制片段
琼脂糖电泳
带有DNA片 段的凝胶
（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)
用于蛋白质定性、定量及相互作用 研究。
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）探针技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光
染料标标记其末端或全链的已知序 列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上 的核苷酸结合，判断是否有同源的 核酸分子存在。
探针标记方法: 放射性： 32P、35S和3H 非放射性：生物素、地高辛素、
荧光素 (FITC、罗丹明)
二、印迹技术（印迹杂交）
Autoradiography
Agarrose gel
Nitrocellulose sheet
Transfer protein
Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
Autoradiography
Autoradiogram Protein band detected by specific antibody
SDS-Polyacrylamide gel
Polymer sheet
Autoradiogram
②
③ ①
分子杂交实验
（二）RNA印迹技术
(Northern blotting)
基本过程与Southern blotting 相似。用于RNA的定性定量 分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
Souther n印迹法
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
Southern和Western印迹法
DNA frangment
Electrophoresis
Transfer of DNA by blotting
32P-labled DNA probe
电转移印迹技术、真空吸引转移印迹
广泛应用于DNA、RNA、 蛋白质检测
印迹技术的分类及应用 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒 和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 常用Ab来检测蛋白质，也被称为免疫 印迹技术 。 靠电转移将蛋白质从凝胶转移到膜上。
蛋白质免疫印迹法
• 实验操作 1 细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的SDS-PAGE； 4 蛋白质的转移； 6 目的蛋白质的检测。
蛋白质免疫印迹法
第二十一章
常用分子生物学技 术的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
生物化学教研室
第一节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
核酸分子杂交 (hybridization)
变性
复性
不同来源的 DNA分子
DNA-DNA 杂交双链分子
复性
RNA
DNA
1. 原理 变性与复性
2. 常见条件：加热 S形曲线 解链温度（Tm） A260增高的原因
3. 分子杂交的目的
核酸分子杂交的应用 研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂
Fra Baidu bibliotek
例：变性引起紫外吸收值的改变
DNA的紫外吸收光谱 ➢ 增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。
热变性
➢解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度
对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm 处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。
蛋白质免疫印迹法
• 免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量 • 测定相对含量时，需要内参照 • 选择合适的反应条件：SDS-PAGE胶浓度；
转移膜的选择；转移时间的选择 • 注意电极的正负极 • 抗体反应时，注意驱除反应袋内气泡 • 操作要轻柔。
三
种
印
迹
12月24日上午9：00
技
术
的
比
较
②
③ ①
分子杂交实验
退火(annealing):
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性
复性条件：Tm －250C 4度以下几乎不复性
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在 DNA 复 性 过 程 中 ， 如 果 把 不 同 DNA 单 链 分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA 放 在 一 起 ， 只 要 在 DNA或 RNA的单链分子之间有一定的碱基配对 关系，就可以在不同的分子之间形成杂 化双链(heteroduplex) 。
➢ Tm：
➢其大小与G+C含量成正比。
(melting temperature)
变性是在一个 相当窄的温度范 围内完成，在这 一范围内，紫外 光吸收值达到最 大值的50%时的 温度称为DNA的 解链温度，又称 融解温度。
DNA的复性 复性(renaturation):
在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢 复天然的双螺旋构象。
放 射 自 显 影 照 片
DNA 点阵
本节要点
1、印迹技术的分类
第二节 聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
从组织或细胞中提取基因组DNA→限制性 内切酶消化→琼脂糖凝胶电泳将DNA按大小分 离→含有DNA区带的凝胶在变性溶液中变性→ DNA 变性后从凝胶转移到固相支持物上→特 异性探针与固着于膜上的DNA杂交→杂交结果
反映待测核酸样品的有关基因信息。
限制性酶切割
DNA分子
限制片段
琼脂糖电泳
带有DNA片 段的凝胶
（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)
用于蛋白质定性、定量及相互作用 研究。
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）探针技术
探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光
染料标标记其末端或全链的已知序 列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上 的核苷酸结合，判断是否有同源的 核酸分子存在。
探针标记方法: 放射性： 32P、35S和3H 非放射性：生物素、地高辛素、
荧光素 (FITC、罗丹明)
二、印迹技术（印迹杂交）
Autoradiography
Agarrose gel
Nitrocellulose sheet
Transfer protein
Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
Autoradiography
Autoradiogram Protein band detected by specific antibody
SDS-Polyacrylamide gel
Polymer sheet
Autoradiogram
②
③ ①
分子杂交实验
（二）RNA印迹技术
(Northern blotting)
基本过程与Southern blotting 相似。用于RNA的定性定量 分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
Souther n印迹法
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜
与放射性标记 DNA探针杂交
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
Southern和Western印迹法
DNA frangment
Electrophoresis
Transfer of DNA by blotting
32P-labled DNA probe