Southern+杂交+-+试剂盒

Southern 杂交

一、目的

二、基本原理

DNA印迹杂交法是指利用毛细管作用，将变性DNA从凝胶上转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，加以固定后用探针杂交的技术。此法是由Dr.Southern 1975年建立的，它是分子生物学研究领域中最常用的技术之一，为后来发展的各种生物大分子杂交技术提供了重要的理论和实践基础。

分子杂交技术是根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行的。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交形成双链DNA分子。

Southern印迹杂交技术是由：电泳，印迹，固定和检测4个步骤组成。即用一种或几种限制性内切酶消化DNA分子，通过琼脂糖凝胶电泳按分子量大小分离所得片段，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶中转移至一固相支持物上（通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜）。DNA转至固相支持物的过程中，各个DNA片段的相对位置保持不变，用放射性标记或非放射性标记的DNA或RNA探针与固定于膜上的DNA分子进行杂交，经放射自显影或显色反应确定所有与探针杂交的片段的位置。

探针很难与琼脂糖凝胶中的DNA进行杂交，因此必须把DNA转移至一固相支持物上。DNA 在高盐存在下，可以通过毛细作用印迹到膜上（目前又发展了真空转移和电转移等技术）。DNA 片段的大小对转移率有很大的影响，大的DNA片段较难定量转移，一般可用短波长紫外线照射凝胶，将其中的DNA断裂为较小的片段，以利转移。实验表明，单链DNA的平均长度在大约1000个碱基时即可充分转移。

能产生可检测杂交信号所需的DNA量取决于几个因素：DNA中与探针互补部分所占比例，探针的大小与比活，膜上DNA的量。在最佳条件下经放射自显影曝光书天后这一方法的灵敏度足以检出不到0.1pg的与高比活32P标记的探针（109cpm/）互补的DNA。Southern印迹杂交方法通常需要10µg基因组DNA。

杂交所用探针一般多采用放射性同位素标记，但由于非放射性探针标记对人体无害，无同位素污染及其后处理等优点，此外，标记的探针可长期保存，随时可用，所以非放射性探针标记越来越受到重视。

本试验采用非放射性地高辛标记技术

非放射性DIG系统利用地高辛（digoxigenin, DIG）标记DNA、RNA或寡核苷酸作探针，以便进行杂交及随后的显色或化学发光检测。

非放射性探针标记方法之一是采用由间壁连接有类固醇半抗原的异羟基泽地黄毒苷配基标

记的dUTP（缩写DIG-dUTP）作为DNA合成的底物，经随机标记法掺入新合成的DNA中，形成非放射性同位素标记探针，杂交后，用相应的碱性磷酸酶酶联抗体检测DIG标记DNA的存在。在X-磷酸盐和硝基蓝四锉盐（NBT）存在下，碱性磷酸酶催化生色反应。显示出所检测的目标DNA所在。

对DNA标记来说，DIG通过一个不耐碱的酯键与dUTP相联。使用不耐碱的DIG-11dUTP 可以更容易和有效地除去膜上的探针，利用第二种DIG标记的探针进行再杂交。不耐碱的DIG-11dUTP标记的DNA探针不能用碱（NaOH）变性。必须在沸水中保温变性。

DNA标记：DIG-High Prime 系统是以随机引物标记的原理标记DNA探针。在5×反应缓冲液中预先混合了随机引物标记的所有试剂，即可节省步骤又可以提高产量和可重复性，十分方便。DIG-High Prime 系统可以用小到200bp的DNA片段、线性化的质粒、粘粒或λDNA甚至超螺旋的质粒作为标记的模板。

DIG-High Prime标记反应的产量：在标准反应中37℃保温1小时，由1μg的对照DNA可以产生800ng的DIG标记的DNA。标记片段的长度为200-1000bp。

杂交：有别于同位素标记的杂交反应，我们推荐使用DIG Easy Hyb（一种可以立即使用的无毒的杂交液），它可以将杂交的时间降到低于4小时。

免疫检测：杂交后的探针与偶联有碱性磷酸酶的抗体（anti-DIG-AP）结合，然后用显色底物NBT/BCIP（见DIG DNA Labeling and Detection kit）或化学发光底物CSPD（见DIG Luminescent Detection Kit for Nucleic Acid）检测与DIG结合的抗体。

步骤反应时间

DNA标记10分钟-过夜

杂交6小时或过夜

免疫检测 1.5小时

显色反应0.5-16小时

三、试剂配制

（1）美莱博（Mylab）公司DIG High Primer Labelling and Dection Sterter Kit I成分这些试剂按下面的配方配制：

缓冲液 1. 马来酸缓冲液（maleic acid buffer）

[含有组分：0.1M maleic acid, 0.15M NaCl; 用固体NaOH将pH调到7.5(20℃)] 配制方法：将马来酸缓冲液（干粉）用800ml水溶解，反复冲洗干净瓶内干粉。检查

pH是否为7.5。定容至1L。灭菌。

缓冲液 2. 洗涤缓冲液（Washing buffer）

马来酸缓冲液加入0.3% Tween20(v/v)

缓冲液 3. 阻断液

将10×阻断液母液用马来酸缓冲液稀释10倍，制备成1×阻断液

缓冲液 4. 检测缓冲液

0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH9.5(20℃)

缓冲液 5. TE缓冲液

10mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH8.0

溶液 6. 抗体溶液

每次使用前，需10，000rpm离心抗DIG-AP酶结合物5分钟，从表面小心吸取

所需的量。用阻断液按1：5000稀释抗体。

溶液 7. 显色溶液（避光存放）

必须新鲜配制：在10ml检测缓冲液中加入200μl NBT/BCIP浓贮备液

（2）显色溶液

必须新鲜配制：在10ml缓冲液3中加入200μl NBT/BCIP浓贮备液（3）采用公司“primer-a-gene” labeling kit 和DIG-dUTP进行探针标记

四、使用仪器

稳压电泳仪；电泳槽；紫外检测仪；电热恒温水浴锅；杂交炉；恒温振荡器等。

用品及器具：保险膜，杂交管，吸水纸，解剖刀，增感屏，瓷盘，镊子，塑料手套，滤纸，尼龙膜等。

五、实验材料

1、样品DNA；

2、DIG-DNA探针

六、实验操作

（一）Southern 转移