菌体细胞裂解法汇总

菌体细胞裂解法汇总
一、反复冻融法：
1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

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2、至少3次以上冻溶。

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3、IFCC推荐法：
收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-200C 冷冻30 min，370C 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。

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4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=142945&replyID=597858&skin=1
二、超声波处理法
1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。

我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。

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2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

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3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。

750W 40％功率。

5秒超声，9秒间隔。

超声至少90min。

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4、综合冻融和超声的方法：
1500g离心，弃除上清。

冰上，用小体积PBS重悬细胞。

将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。

液氮骤冷。

用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。

可选择：4℃下超声破碎细胞。

加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT。

4℃下111500g×60min离心裂解液。

取出上清。

过柱子。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol
三、渗透法：
冰冷的20 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），2.5 mmol/L EDTA处理，冰浴放置10min。

《精编分子生物学实验指南》
四、裂解液处理法：
1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。

SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

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2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。

SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。

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3、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。

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4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml 蒸馏水。

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5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不就可以了吗？
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6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2×上样缓冲液，煮10min，取20ul上样，就可以了。

/bbs/post/iew?bid=65&id=4591035&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#4591 035
7、检测蛋白诱导：
从培养的不同时期各取出1ml，12000g×1min离心。

将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl（pH6.8），100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油）中，100℃加热3min，然后12000g×1min离心。

上样15ul，6％SDS-PAGE电泳。

《分子克隆》P826
8、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。

加入1ul PMSF，再加入50ul热的2×SDS 上样缓冲液（100℃加热）。

迅速混匀后100℃加热3-5min。

将样品冰上放置（或-20℃放置），然后再溶解，煮沸1min。

离心30秒。

上样5ul进行SDS-PAGE电泳。

2×SDS上样缓冲液：250mM Tris-Cl，6.2％（w/）DTT，8％SDS，0.002％（w/）溴酚蓝，40％甘油。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。

9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。

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10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。

）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放30－60min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。

/dispbbs.asp?BoardID=89&ID=112749&replyID=421724&skin=1 11、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg/ml Aprotinin，1% Triton X-100 ( or NP-40)。

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12、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。

50mmol/L Tirs-HCl(PH 8.0)、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ( or NP-40) ，这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。

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13、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。

推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4（缓冲体系），150 mM NaCl（等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1 mM EDTA（变性剂和稳定剂），5 µg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂），5 µg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100（破坏细胞），1% Sodium deoxycholate（中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS（强变性剂和蛋白溶解剂）。

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14、裂解buffer：50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT（还原剂），7M 尿素，2M 硫脲(可以提高膜蛋白的融解），1mM EDTA(金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin，1mg/ml pepstatin(蛋白酶抑制剂），50mM NaF(ph7.0)（anti hemoaggulating），1mM Na3O4(ph7.0)（inhibitor of phosphatases），2mM benzamidine （inhibitor of trypsin）。

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15、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2min。

弃除上清，用100ul 1×SDS上样缓冲液重悬，冰上放置。

6000rpm×10min离心培养物。

弃除上清，用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。

液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。

在冷水中溶解细胞。

15秒、4次超声处理细胞。

冰浴降温。

4℃，9000g×30min离心。

取上清。

裂解液：5 mM DTT，15 mM KCl，5 mM MgCl2，50 mM HEPES, pH 7.9，1 mM EDTA，10 mg/ml溶菌酶（临用前加上DTT和溶菌酶）。

Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol
16、收集细胞。

在液氮中突然冷冻细胞。

用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。

用100 µg/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。

加上10% N-laurylsarcosine (终浓度1.5%)，然后超声波破碎。

16000 rpm×30 min离心。

取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。

过Ni-NTA–琼脂糖柱层析。