基因工程工程菌构建概要

（2） 1，3．丙二醇氧化还原酶的酶活力测定
测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活。酶活测定根据 250C条件下NAD+还原成NADH的速率来定量。酶活 单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物 NAD+或生成1“raol产物NADH的酶量。
四、重组菌coliJMl09(pEtac— dhaB—tac-yqhD， pUC—tac—dhaT)发酵培养基优化
94℃预变性5min：变性90 s，54℃退火l 5min，72℃ 延伸l 5rain，循环35次；72℃保温10min。
（1）大肠杆菌基因工程菌的构建
将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT连入载体pEtae， 以得到的重组质粒pEtac-dhaT。经酶切得到片段tacdhaT连接到pUCl9上，以得到的重组质粒pUC-tacdhaT。将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtacdhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。
1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克 隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同 工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷 伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建 了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tacyqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并 在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒 pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT， 研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途 径。
一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达
材料
1，菌株、质粒及基因片断： 大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由 本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠 杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。 2，主要试剂： 质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化 试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲 叉双丙烯酰胺、
3、在通过正交实验优化后的培养基中，重组菌 EcoliJMl09(pEtae—dhaB．tac-yqhD)与E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD，pUC．tac—dhaT) 经诱导前后1，3．丙二醇的产量分别为0．3∥L、1．943 g／L及O．3∥L、2．432 g／L。发酵24小时后，重组菌 EcoliJM109(pEtac—dhaB—tac-yqhDDpUC—tac— dhaT)L[',Ecoli JM109(pEtac—dhaB-tac-yqhD)l，3· 丙二 醇产量提高了25．1％。可见，由甘油到1，3-PD的反应， 限速步骤是3．羟基丙醛到1，3。丙二醇的反应。本研究 成功构建了在大肠杆菌中利用了两种辅酶(NADH、 NADPH)的共表达，减少3．羟基丙醛的累积，提高了1， 3-PD的产量。
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(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过 夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃ 振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌 液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中， Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰 水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL，
1，3-丙二醇性质
• 物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l， 3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、 乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相 对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点 211℃，自燃温度为400℃。 • 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐 及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重 要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。
（五）、酶活力测定
1、甘油脱水酶活力的测定 2、1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的酶 活力测定
（六）、1，3．丙二醇含量的测定
发酵液中l，3：．丙二醇及甘油的含量 采用气相色谱测定 ，国产高分子微 GDX．401(110目)为固定相。柱温：250℃， 进样温度：240℃，检测温度t 240℃，氮气 作为载气，使用氢火焰检测器，进样5“L， 1，3．丙二醇的保留时间为2．7 min左右， 用外标法计算发酵液中1，3一丙二醇的含量。
轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。 （6)重复步骤(5)两次。 (7)8000r／min离心5min，然后静置2min， 冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL。 也可加40 uL50％的甘油保存代用。
（三）、转化大肠杆菌
(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。 (2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可 用漩涡混合仪。 (3)冰水浴40min。 (4)42℃热激90s。 (5)加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1．2 h。 (6)涂布含有相应抗生素的LB平板。
1，3．丙二醇生物合成途径
l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并 未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘 油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还 原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类 发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的 ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH； 还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生 成1，3一丙二醇 。
6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管 中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓 冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r ／min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建
生物技术1101班 李娟
1，3．丙二醇简介
1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大 石化新产品之一，其主要功能是作为合成 聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙 二醇的生产方法有化学合成法和微生物转 化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发 酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产 周期长和转化率低等问题，目前仅有化学 合成法应用于工业生产。因此，利用基因 工程技术构建高产菌株备被认为是今后的 发展方向。
（一）、质粒DNA的提取
(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。 (2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min， 离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀，
材料
菌株：重组菌Ecoli JMl09(pEtac．dhaB-tacyqhD，pUC—tac—dhaT)为本论文三中构建。
培养基和培养条件
LB培养基(∥L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化 钠lO，琼脂15(固体培养基)，固 体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至100}tg ／mL、卡那霉素50p．g／mL。 种子培养基：采用LB培养基。 发酵培养基(g／L)：甘油、酵母膏、KH2P04、 MgS04· 7H20和维生素B12 青霉素至100Ixg／mL、 卡那霉素50rtg／mL。
方法
摇瓶发酵：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株 接入50 mL摇瓶(装液量为10mL)中，于旋转式摇床中37℃、 150 r／min培养18 h得到种子液。接种于250 mL摇瓶中， 在150 r／min旋转式摇床中，先于37。C培养至OD600为 O．7，再于37℃诱导发酵一定时间。
小结
1、采用单因素实验分别考察了不同浓度的甘油、酵母 膏、KH2P04、VBl2及M孑+ 等因素对重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB—tac-yqhD， pUC—tac—dhaT)发酵结果的影响，确 定了其发酵培养基的基本组成为：甘油20g／L、 VBl20．01g／L、KH2P047．5edL、M92+0．67 g／L和酵母膏5∥L，在此培养基中l，3一丙二醇的产量 达到2．25∥L。
1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线
(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱 水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3 一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建 重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考 察其转化甘油的能力。 (2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇 氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口 T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac— dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。 (3)在摇瓶水平，对已构建的产1，3．丙二醇重组菌
2、通过正交实验分析法进一步优化了重组菌E coliJMl09(pEtac-dhaB．tac-yqhD， pUC—tac-dhaT)的发酵培养基，其适宜组成为：甘油20 g／L、VBl2 O．01 g／L、KH2P045 g／L、 M92+0．67 edL和酵母膏5∥L。最适发酵条件为：装液 量10％、接种量10％、转速150 r／min、接种后4d,时左右加入IPTG、IPTG终浓度为 lmmol／L。应用此培养基l，3．丙二醇 的产量为2．4329／L，
PCR反应体系及反应条件：PCR反应体系：
在0 5 mL Eppendorf管中按顺序加入以下试剂： 10×buffer 5 m，2 5mmol／LdNTP4lLl，MgCl24IlI， 上下游引物各1 IIl，模板DNA2 pl，脚酶1 itl，ddH20 32m，总体积50 pl。
1．3一丙二醇氧化还原酶dhaT的反应条件：
（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建
首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD 连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtacyqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体 pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将 来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体 pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒 pUC．dhaB．tac-yqhD。将重组表达载体酶 切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大 肠杆菌JM 109(pEtac—dhaB-tac-yqhD)。
1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。 • 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
二、重组质粒pUC—tac-dhaT的构 建及其与pEtac—dhaB—tac-yqhD 在大肠杆菌JMl09中共表达
实验材料
菌种：E coliJMl09(pEtac-dhaB—tac-yqhD)为本
研究“第二章"构建保存的；质粒pUCl9， pEtac由本实验室保藏：dhaT基因从克雷伯氏菌中 试剂和工具酶：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试 剂盒、质粒纯化试剂盒 工具酶、抗生素 公司、华美生 物 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 3PCR引物 根据克 雷伯氏菌公布的序列， 。
引物： 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公 布的序列，设计片段pEtac．dhaTPCR所 需引物：Ps：5’ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTT G一3’： P6：5'-ACC CAGAATGCCTGGCG．3’。 引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点。
实验条件和方法