酵母活力检测方法

载玻片培养法评价酵母活力与活性本方法的目的是提供一种估计酵母样品中存在的活细胞的百分数。

1、原理：将酵母细胞悬浮液混于麦芽浸出物——明胶培养基内，在血球记

数板上涂布而后进行培养，允许活细胞生长形成微小菌落，利用显微镜观察并估计所形成的活细胞的百分数。

2、试剂：

a、培养基称取明胶12g, 麦芽浸出物0.6g, 酵母浸出物0.6g,

蛋白胨 1g, 葡萄糖2g，溶解到100ml水中。115℃灭菌30分钟，灭菌后

冷却备用。

b、生理盐水称取0.85gNaCL，溶于100ml水中。蒸汽灭菌。

C、凡士林

3、装置

血球记数板，显微镜，培养箱，盖玻片，无菌吸管

4、步骤

将酵母样品加到生理盐水中，使细胞浓度准确的为5---10×106个/ml.然后将该悬浮液与等体积的溶化的明胶培养基混合，取两滴混合物与血球记数板的方格处，轻轻的在其上方盖上一片盖玻片，用凡士林将盖玻片周围密封，防止干燥。将血球记数板放在培养箱中培养。隔适当的时间（2—3个小时），用显微镜观察生长情况。

5、结果描述记录刚涂片时的酵母总数，过适当的时间（根据所选温度而定，

如在37℃培养，所用时间相应减少，3小时就可以，25℃培养，时间相应较长，具体根据实验情况而定），再进行记数，此时把多于三个以上的细胞群落作为具有增殖能力的细胞，小于三个一律不做记数。计算形成微小细胞群落的比例。

注意：要固定一个视野，不变，才有记数的意义。可选几个视野求平均。

7、方法讨论

a.方法的测定范围和样品的选取

虽然载玻片培养法测定比较准确，但操作起来必须要严格要求，因为要涉及到后面的记数，所以在载玻片上最好固定一个视野，如果不好操作，

可以用血球记数板代替。选取待测样品时最好不用处于对数生长期的酵母，因为此时酵母出芽率很高，不好记数，可以选择升压以后的酵母或者酵母泥。以下是两个对比，图A1、A2、A3为选取对数生长期的酵母样品25℃分别培养3小时，五小时后的状态。图B1、B2、B3为选取升压三天后的酵母样品25℃分别培养3小时，五小时后的状态。可以看到，对数生长期的酵母在开始时的出芽率很高，难于记数。

A1 A2

A3 B1

B2 B3

b 、培养时间和温度的确定

合适的培养温度可以使测定的时间缩短，但温度不要太高，太高了就抑制活率，一般选择25℃或者35℃，下面是做的温度和时间对照，从图中可以看出，25℃培养酵母形成菌落较慢，测定的时间要大于4小时，而35℃培养三个小时之后就可以看到大的菌落已经形成，可以用来记数。因此，可以在较高的温度下培养从而缩短检测的时间。

25℃培养0小时 25℃培养2小时

25℃培养3小时25℃培养4小时

35℃培养0小时35℃培养2小时

35℃培养3小时35℃培养4小时

c、最佳稀释度的确定

如果细胞涂布时浓度过高或者没有被打散，增殖形成微小菌落以后很容易重叠到一块，这样就对记数造成困难，造成实验误差。因此选择合适的稀释浓度，保证均匀分散的细胞悬液是本方法成败的关键。一般用生理盐水将菌体稀释到5---10×106个/ml.，最好是5×106个/ml.左右。然后和明胶培养基1：1混合，达到终浓度2.5×106个/ml.左右，就可以得到均匀分散的涂布状态。但稀释倍数也不宜过大，否则误差会很高。总体原则是得到均匀分散的单细胞。

d. 和染色法结果的对比

酵母代数染色法测死亡——活率培养法活率

零代 0.5%——99.5% 99.9%

一代 0.9%——99.1% 96.5%

二代 1.5%——98.5% 95%

三代 1.9%——98.1% 93%

四代 2.1%——97.8% 91.4%

五代 2.3%——97.7% 86.3%

从总体的培养效果看。在活率很高的情况下，两种方法的差别不是很大，但随着酵母活率的降低，两者开始出现差异，培养法测的值要低于染色法的值，说明染色法在酵母活率明显降低的情况下，过高的估计了酵母的存活能力。

结论：

从简单实用的角度出发，染色法和载玻片培养法都是企业可以应用的方法，染色法简单快速，但准确率不高，培养法准确率较高，但对操作的要求也很高，用的时间也较长。总之，两者可以结合使用，常规高频率的检测可以使用染色法，定期的酵母的活率测定可以使用载玻片培养法。结合前面的影响酵母活力的因素，优化并严格控制各种操作条件，使酵母在最合适的生理状态下发酵，会使产品的

质量更加稳定和提高。