常见细胞实验流程

实验前准备

●根据自己实验的情况提前预定超净台

●进入细胞室之前必须穿鞋套，戴手套

●将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min

高压灭菌操作

1.将所需灭菌的枪头，EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中，并用报纸将枪头盒包

好。

2.将仪器放入灭菌锅之前，首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈，

若没有超过则需加水。

3.检测水位之后，将包好的器材放入锅内，盖上锅盖并拧紧螺丝。

4.插上电源，先将电压调至250V，目的在于排尽锅内的空气，（当排气阀有白

气冒出时，说明空气已排尽）空气排尽后，关闭排气阀。

5.关闭排气阀后指针上升，当指针竖直时，将电压调至125V，保持锅内压力的

稳定。

6.开始计时，灭菌30min。结束时关闭电源，等至指针慢慢降下即可。

7.拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干，2天后即可拿出。

（组织内）蛋白质提取过程

1.对癌组织和癌旁正常组织进行称重，记录数值。

2.根据RIPA裂解液Ⅲ说明书（每100mg组织中加入1ml溶液A，1ul溶液B，

5ul溶液C）按照组织块得大小配好ABC混合液。

3.将组织块加入匀浆器中，并加入相应量得ABC混合液，冰上静置5-10min，

开始研磨。

4.将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中，12000rpm/5min.

5.离心结束后，收集上清液，弃去沉淀，上清即为所要的蛋白。

蛋白质浓度测定

1、取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可

2、配制BCA标准蛋白液：

浓度原液体积去离子水体积

A管：2000ug /ul 30ul 0ul

B管：1500ug/ul 37.5ul 12.5ul

C管：1000ug/ul 25ul 25ul

D管：750ug/ul 18.75ul 31.25ul

E管：500ug/ul 12.5ul 37.5ul

F管：125ug/ul 3.125ul 46.875ul

G管：25ug/ul 0.625ul 49.375ul

H管：0 0ul 50ul

●取8个EP管，分别标上以上字母，并按上表加入相应的原液蛋白和

去离子水

●先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液（根据实验计算所需要用

孔的个数加入底物液）

●加完后，将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列

上的字母标记依次加入

●之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品（每个样品应重复2次）

●加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好，以防止蛋白浓度发生变化，

之后将板放入保温箱中静置30min

●30min后将96孔板拿出放入测量仪器内（应按照仪器使用说明进行

操作）

●数据测完后另建文件夹，保存数据，之后插入尤盘拷取数据

●在获得的数据结果中，根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下

对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线：

y=ax+b（计算机上操作）

●将测得的蛋白样品的OD值带入公式，即可求出蛋白样品的浓度

●若实验有实验组和对照组，应将两组的蛋白浓度标准化，即是两组

的蛋白浓度相同（相同浓度下的两组实验才具可比性）

●将浓度标准化的样品蛋白与loading buffer 混匀至100ul（混合液中

loading buffer应为1X的，但实验室的一般为5X），稀释方法：取

20ul 5Xloading buffer +80ul 样品蛋白混匀即可

●在加样做western blot之前，蛋白样品需变性：

将与loading buffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变

性10min（EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开）

（组织内）RNA提取过程

1.将组织放入匀浆器中，加入1ml的Trizol，冰上静置10min，进行研磨。

2.将匀浆好的上清转移至1.5ml EP管中，进行离心12000rpm/5min.

3.离心后收集上清液于新的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈摇匀后静置

5min，然后12000rpm/5min.

4.离心后取上清于另一新的EP管中，取液时不要取到中间层的蛋白。之后

按1:1的比例加入异丙醇，摇匀后静置15min，进行离心12000rpm/10min。

5.离心后倒掉上清（可看到白色RNA沉淀），加入1ml 75%乙醇DEPC水溶

液温和震荡，悬浮沉淀，3000rpm/5min.

6.倒掉上清，在滤纸上空干。然后加入20ul DEPC水溶解沉淀，并吹打均

匀。（如果RNA量较多，可相应的加更多的DEPC水，40ul 甚至60ul）7.测定RNA浓度，取1ul RNA+99ul DEPC水于EP管中（相当于稀释100倍），

另取一EP管放100ul的DEPC 水用于定标。定标后倒掉，用去离子水冲洗比色皿，然后测定RNA OD值和浓度，记下数据。

8.RNA电泳（用于检测提取的RNA是否已降解）

●配胶(1%的胶)：取0.2g 琼脂糖+ 20ml TAE +1ul EB

●制胶时，应让液体沸腾3次，冷却后加入EB混匀（每20ml加1ulEB）,

胶制好后倒入板中凝固，并垂直地插入梳子，静置30min 后拔下梳

子（可提前用梳子划动下胶，使得胶更均匀）。

●取1ul的Loading buffer和样本RNA混匀，加样

正确的电泳结果应有3条带：28S 、18S、5S。28S亮度应为18S亮度的