蛋白质的分离纯化与定性定量分析资料
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。
这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。
理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。
目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。
经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。
对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。
对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。
百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定(共14张PPT)
原理
蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分
子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间相互作用增强， 因而溶解度增加
盐析的影响因素
➢蛋白质的种类：
分子量越大，沉淀所需盐的量越少（卵球蛋白>卵清蛋白）
蛋白质分子不对称性越大，越容易沉淀
➢温度：
高离子强度溶液中，升高温度有利于蛋白质的失水沉淀 低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范
常为凝胶柱床体积的1%-10% ➢洗脱速度要恒定
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，
严禁将凝胶丢弃或倒入水池中
实验三脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1.硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。
➢从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀 ➢实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(硫酸铵溶液)
➢SephadexG-25：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300µm，筛 孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子
从内水体积流出。
实验一卵清球蛋白的盐析分离
0.7ml卵清+0.7ml饱和硫酸铵溶液（每组2个EP管）
混合均匀（避免产生气泡）
静置3-5分钟，蛋白质析出
3000rห้องสมุดไป่ตู้m，离心3分钟 用移液枪去除上清（含卵清白蛋白）
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定
➢材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
➢前处理及裂解细胞（匀浆器、研钵、超声波、反复冻融、
酶解等） ➢蛋白质粗分级分离（水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂、
盐析、有机溶剂分级分离、等电点分离）
蛋白质的提取纯化及定量
生命科学学院
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验原理
1、蛋白质的提取：盐析法或等电点法。 2、蛋白质的分离纯化---
生 物 化 学 实 验
凝胶过滤法（分子排阻层 析法）:它是以各种凝胶 做固定相,利用流动相中所 含各物质的相对分子质量 不同而达到物质分离的目 的。葡聚糖凝胶 （Sephadex）是最常用 的凝胶,又称右旋糖苷,它 是葡萄糖通过α－1,6－糖 苷键形成的长链—葡聚糖 在交联剂表氯醇（环氧氯 丙烷）作用下形成的三维 空间网状结构（见图）,具 有分子筛效应及水不溶性。 Exit
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、蛋白质的提取
二、蛋白质的脱盐——凝胶过滤
三.蛋白质的定量
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
一.蛋白质的提取
生 物 化 学 实 验
取鸡蛋一只，取蛋清加无离子水至 50ml，搅拌成均匀的胶体溶液。用六层纱 布过滤，取2ml蛋清溶液于试管中，加入 硫酸铵至饱和状态，2000r/min离心 10min,去上清液，加入水至沉淀刚好溶解， 测量体积。
回归方程式及相关系数的推导。 （y=ax+b R2=)
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蛋白质的提取、分离纯化及定量 752分光光度计
生 物 化 学 实 验
y 1.81.5577x + 0.0901 = 1.6 R 2 = 0.9883 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 1 1.5
Exit
系列1 线性 (系列 1)
生命科学学院
蛋白质的提取、分离纯化及定量
U2100分光光度计
生 物 化 学 实 验
蛋白质的定量和定性分析方法
蛋白质的定量和定性分析方法蛋白质是生物体内最重要的功能分子之一，对于研究生物体的结构和功能具有重要意义。
为了准确地了解蛋白质的含量和性质，在科学研究和实际应用中，我们需要使用定量和定性分析的方法来研究蛋白质。
一、定量分析方法1. 低里德伯法（Lowry method）低里德伯法是一种经典而广泛应用的蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与碱式铜络合物在碱性条件下反应生成蓝色产物，通过比色法测定溶液的吸光度来计算蛋白质含量。
这是一种灵敏且相对简单的方法，适用于大多数蛋白质样品的定量分析。
2. 比色法（Colorimetric assay）比色法是一种常用的蛋白质定量方法，通过蛋白质与染料的结合来测定蛋白质浓度。
常用的染料有布拉德福蓝（Bradford）、库吉铃蓝（Coomassie Brilliant Blue）、BCA法（Bicinchoninic Acid assay）等。
这些染料与蛋白质结合后形成一种复色物，通过比色法测定溶液的吸光度可以定量分析蛋白质。
比色法具有操作简便、灵敏度高等特点，被广泛应用于蛋白质定量领域。
3. 分子标记法（Molecular tagging method）分子标记法是一种新兴的蛋白质定量方法，利用特定的分子标记物（如荧光染料、放射性示踪剂等）标记蛋白质，然后通过测定标记物的荧光强度或放射性信号来计算蛋白质浓度。
分子标记法具有高灵敏度、高特异性等优点，适用于微量蛋白质的定量测定。
二、定性分析方法1. SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）SDS-PAGE是一种常用的蛋白质定性分析方法，通过电泳将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离出来。
在电泳过程中，蛋白质在SDS（十二烷基硫酸钠）的作用下具有相同的电荷密度，只受到大小的限制而移动。
蛋白质在凝胶中的分离程度取决于其分子量大小，可以通过对比标准品的迁移距离来估计样品中蛋白质的相对分子量。
蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解课件讲解学习
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
玻璃匀浆机
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相 互摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可 达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于 动物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
第二章蛋白质的定性定量分析【共54张PPT】
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的 电荷差异
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
对各种纯化蛋白质反应不同
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定
SDS与蛋白质之间的结合程度
SDS-PAGE基本原理
封闭非特异结合位点 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；
Watch SDS-PAGE原理
Watch SDS-PAGE原理
80-100 ug/cm2
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白
+
pH 3
pH 7.5
Isoelectric Focusing
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
3–10
3–10NL 4–7 3–6
5–8
7–10
ReadyStripTM IPG Strips
蛋白质的分离、纯化和相对分子量的测定
3、凝胶过滤 、
（二）利用溶解度差别的纯化方法
1.等电点沉淀 1.等电点沉淀 调整溶液pH 调整溶液 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 处依次沉淀 2.盐溶和盐析 2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜
（三）根据蛋白质带电性质分离
1 电泳 各种蛋白质都有其特有的等电点，在高 于其等电点PH的缓冲液中，将形成带负电 荷的质点，在电场中向正极泳动，在同一 条件下，不同蛋白质带电荷有差异，分子 量大小也不同，所以泳动速度不同 。
（三)根据电荷不同的分离方法—电泳
原理： 原理： • 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 • 分子大小不同，电场中移动速度也不同 分子大小不同，
2 离子交换层析
等电聚焦电泳
双向电泳
离子交换层析
（四）利用蛋白质选择性吸附的性质
• 羟磷石灰层析 • 疏水作用层析
（五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法具有极 Nhomakorabea的专一性
亲和色谱颗粒
六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 （略）
蛋白质的分离纯化
一、蛋白质分离纯化的一般原则
总目标：增加制品纯度或比活 总目标： 1.预处理：因动/植物/ 1.预处理：因动/植物/细菌而异 预处理 2.粗提：采用盐析/等电点沉淀/ 2.粗提：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂 粗提 等方法将蛋白质沉淀。 等方法将蛋白质沉淀。 3.精制： 3.精制：采用电泳技术和层析技术是不同 精制 蛋白质分离。 蛋白质分离。 4.结晶 4.结晶
二、蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 、 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料
蛋白质分离纯化技术实验讲义
实验一蛋白质含量分析（Bradford检测法）一、实验目的1、制作蛋白质浓度标准曲线；2、测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。
二、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。
该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。
此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；MiliQ水。
2、器材：滤纸；烧杯；漏斗；可见分光光度计；试管。
四、实验方法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml 无水乙醇后，再加入100 ml 85%的磷酸，加MiliQ水定容至1 L，过滤备用。
2、标准蛋白溶液的稀释取10支试管，按表中顺序排列，分别加入考马斯亮蓝溶液、水和样品。
每加完一管，立即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，塑料比色皿不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
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怎样纯化蛋白质？
❖ 生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 异，来分离或纯化它。
❖ 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
▪ 可溶性：硫酸铵沉淀 ▪ 等电点：离子交换层析 ▪ 分子大小：凝胶过滤层析 ▪ 生物学性质：亲和层析
1. 离子交换层析
❖ 离子交换层析利用物质的电荷与层析载体（离子 交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离纯化的 目的，属于吸附层析。
❖ 层析是利用物质在固定相与流动相之间不同的分 配比例，达到分离目的的技术。
❖ 固定相：固定相是层析的基质。通常是固体（如 吸附剂，凝胶，离子交换剂等），能与待分离的 化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。
❖ 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时 称为展层剂。
Then charge of the proteins:
(-)
(-)
(+)
(+)
++
++
++
++
++
Anion exchange column = + charged
++
-+ +
-
+
-++
+
Ion-Exchange chromatography
-
-
+
+
-+
+
+
-
-
+
+
Na+ - Na+ -
Na+ -
蛋白质的分离纯化 与定性定量分析
什么是蛋白质的分离纯化
❖ 分离：将蛋白质混合物分成单一的蛋白成分。 ❖ 纯化：得到单一蛋白的纯品。
为什么要纯化蛋白质？
❖ 研究特定蛋白质的生物学功能（酶、生物活性 蛋白，etc）
❖ 制备抗体 ❖ 蛋白质晶体学研究 ❖ 研究蛋白质-蛋白质相互作用
怎样纯化蛋白质？
❖ 生化学家根据特定蛋白质与其他蛋白质的性质差 异，来分离或纯化它。
❖ 离子交换层析的固定相称为离子交换剂，由基质 和基团两部分组成。
① 基质：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二 乙烯苯等高分子聚合物；
② 基团：共价结合在基质上的带电基团，可分为 正电基团和负电基团。
Ion-Exchange chromatography
-
-
+ห้องสมุดไป่ตู้
+
If pH mobile phase =7.2
❖ 如果蛋白质定位于某一细胞器，可用差速离心法 将其分离。
相对离心力/×g 1 000 4 000
15 000 30 000
100 000
时间/min 5 10
20 30
3～10 h
沉降的组分 真核细胞 叶绿体、细胞碎片、 细胞核 线粒体、细菌 溶酶体、细菌细胞
碎片 核糖体
2. 粗分级分离（rough fractionation） 获得蛋白质提取液后，用一定方法，将蛋白质与 其它杂蛋白分离开来。 常用方法：盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分 离等 特点：简便、处理量大、既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。
3. 细分级分离（fine fractionation） 主要方法： 层析：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析等
1. 蛋白质的层析分离
层析（chromatography）
❖ chrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为 “写”。“层析”就是“色谱” 。
❖层析最早由俄国植物学家 Цвет 于1903年创造， 1941年英国学者Martin和Synge提出分配层析，此 后这种方法得到很大的发展。
❖ 可溶性、等电点、分子大小、生物学性质……
▪ 可溶性：硫酸铵沉淀 ▪ 等电点：离子交换层析 ▪ 分子大小：凝胶过滤层析 ▪ 生物学性质：亲和层析
蛋白质纯化的基本设计原则
❖ 原料应易得到，并尽可能富含目的蛋白； ❖ 应有特异性的蛋白质检测方法（最重要的因素，
决定了纯化能否成功）； ❖ 分级分离，先粗后细； ❖ 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。
+
+
+
+
+ Na+-Na+
Na+
+
Na+
Na+ -
Na+
Increased salt concentration
Cl- + + Cl-
Cl- +
+ Cl-
+ ClCl- +
基本操作过程
1. 样品制备，装柱与平衡 2. 上样（样品溶解于A液中） 3. 洗脱：穿透峰，洗脱峰 4. 收集、鉴定
离子交换层析有两种洗脱方式
蛋白质的检测方法
❖ 蛋白质的活性检测方法：必须快，必须是特异 性的
❖ 蛋白质的免疫学检测方法：western-blot，前提 是有特异的抗体
分离纯化的一般程序
1. 前处理（取决于采用的材料） 动物材料处理：剔除结缔组织和脂肪组织 种子处理：去种皮，有机溶剂脱脂 动物细胞破碎：匀浆器、超声波处理 植物组织：研磨，纤维素酶 细菌破碎：超声波，溶菌酶
❖ 分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动 相分次洗脱样品蛋白的方法；
❖ 梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。 ❖ 目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情
况下的首选方案。
分步洗脱
梯度洗脱
2. 凝胶过滤层析
❖ 利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度 不同来分离蛋白质的方法。
❖固定相：凝胶颗粒（gel bead），多孔的网状结构， 其网孔决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶 分离的蛋白质混合物的Mr范围，如Sephadex G-50 的分离范围是1500～30000。
❖ 常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、 Superdex等。
Size-exclusion chromatography
Size-exclusion chromatography
Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移 动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相 展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层 析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使用； 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。 生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和 层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。