pAAV-MCS腺病毒载体使用说明

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腺病毒中文操作手册

腺病毒中文操作手册Revised on November 25, 2020腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介1第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3技术概况3 系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程4将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体AmpAmpicillin氨苄青霉素β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶bpBasePair碱基对BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNAcccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNACPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum 胎牛血清HrHour小时ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素kbKilobases千碱基对KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点MinMinute分钟MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNAMWCOMOIecularWeightCut-offPAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白TETris/EDTATE溶液wtWildType野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒载体操作手册中文版解析

腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒中文操作手册

腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

aav使用方法

aav使用方法AAV（Adeno-associated virus）是一种非致病性的病毒载体，被广泛用于基因治疗和基因传递研究中。

下面我将介绍一些AAV的使用方法，以帮助您更好地了解和应用这一技术。

首先，选择适当的AAV载体是非常重要的。

AAV载体通常包括表达载体和转染载体。

表达载体用于包装所需基因，转染载体用于将AAV转染至细胞内。

确保选择合适的载体以满足您的实验目的。

其次，AAV的包装和扩增是关键步骤。

将所需基因插入到表达载体中，然后利用辅助载体（helper plasmid）的帮助，通过共转染的方式将表达载体转染至细胞中。

随后，通过细胞培养和收割，可以得到包装好的AAV病毒颗粒。

这些病毒颗粒可以通过超速离心等方法进行扩增和浓缩。

接下来，需要确定适当的AAV转染剂量。

不同实验目的和细胞类型可能需要不同的AAV转染剂量。

一般来说，低剂量的转染可能导致较低的基因表达，而高剂量的转染则可能引起细胞毒性。

因此，需要进行一系列的剂量优化实验，以确定最适合您实验需求的转染剂量。

在进行AAV转染实验时，还需要选择适当的转染方法。

AAV可以通过直接加入培养基或使用转染试剂等方法转染至细胞内。

不同细胞类型对转染条件的敏感性可能有所不同，因此根据细胞类型选择适合的转染方法。

最后，进行AAV转染后的细胞应进行进一步的验证和分析。

通过检测基因表达水平、蛋白质水平或功能实验证明AAV的转染效果。

此外，还可以通过可能的负向对照组进行对比，以确保所观察到的效果是由AAV引起的。

综上所述，AAV是一种强大的基因工具，用于基因治疗和基因传递研究。

通过选择适当的载体和转染剂量，并结合合适的转染方法，可以实现高效、可靠的AAV转染。

进一步的验证和分析则可以确保所观察到的效果的可靠性。

希望这些方法能对您的研究工作有所帮助。

pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐hSyn-‐RFP编号载体名称北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。

稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A 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pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。

腺病毒载体疫苗

腺病毒载体疫苗什么是腺病毒载体疫苗腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体,将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。

腺病毒载体疫苗特点研究发现,携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫.此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。

腺病毒载体疫苗的临床研究1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。

研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒,6h即可检测到IL-6、IL—1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集,在恒河猴中也观察到类似现象.2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。

腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。

如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体,保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击.3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。

大量的临床前和临床研究发现,腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T细胞反应。

有研究报道，携带恶性疟原虫抗原ME.TRAP的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T细胞免疫反应,最高能达到92％的保护率。

4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点.黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。

腺病毒包装操作手册

汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度(PFU的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1:汉恒生物腺病毒载体附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要!!!*1腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别内操作。

2操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3操作病毒时需要特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

4接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。

5如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。

6病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。

7实验完毕后请用香皂清洗双手。

➢腺病毒储存与稀释的注意事项1腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳;如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。

注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%,因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。

汉恒生物对病毒已进行分装(200 μl/tube,收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。

b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴度测定方法。

2腺病毒的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。

重组腺病毒具有以下几个显著优点:感染范围广,几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织;感染效率高达100%,可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染;对外源基因容载能力大(可以高达8Kb;不整合基因组;滴度高,操作方便。

腺相关病毒操作技巧——轻松入门剖析

rep
ITR Replication
cap
Capsid ITR
过表达
pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen
4.8 kb
● 组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱，如心脏、肝脏、肌肉以及各种神经元特异的启动子等； ● 病毒产品全部经过无菌、无支原体、无内毒素检测，让实验安全放心。
＋
汉恒生物AAV主要载体及现货列表
1、汉恒生物AAV主要载体列表（表1）
（部分组织特异性启动子如心脏、肝脏、肌肉等没有在表中列出，欢迎咨询定制。）
CMV（人巨细胞病毒启动子），广谱，强
EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry
Gi- DREADD
pHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry
mCherry
是
Gq-DREADD
pHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry
mCherry
否
● 常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制； ● AAV介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表3）； ● 双标、单标LC3自噬流监测工具（见表5）； ● 组织特异性AAV-DIO载体的定制（原理见附件1）。

腺病毒载体AVV的作用

腺病毒载体AVV的作用
典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。

pCA13/的HCMV IE啟动子－多克隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。

pBHG11因為缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。

外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。

pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装產生腺病毒颗粒。

该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。

腺相关病毒操作手册--汉恒生物

汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。

AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。

rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。

腺相关病毒（AAV）包装技巧

腺相关病毒（AAV）包装技巧上文已经介绍了腺相关病毒的基础知识，具有如此多优点、功能如此强大的腺相关病毒是如何生产的？本文将为大家揭开腺相关病毒生产的神秘面纱。

腺相关病毒生产流程大致可分为基因克隆、细胞转染、收毒、病毒纯化、滴度检测等步骤，具体步骤我们下文分解？怎么可能，下面就是腺相关病毒生产流程。

1）根据订单不同选择不同的载体，在此以人源基因克隆为例。

2）Vigenebio 公司的 AAV 载体与我们的人源 ORF （注：维真生物拥有18000人源cDNA ORF克隆，可以最快的时间克隆到载体）库中的穿梭质粒的多克隆位点相兼容，通过酶切，连接，转化的方式将基因亚克隆进入 pAV-FH AAV 载体，得到阳性克隆之后进行酶切跑胶验证及测序以确认插曲片段的正确性。

细胞冻存流程1) 按照培养细胞流程，将细胞吹下来加入 50ml 离心管中， 800g 离心5min。

2) 配制冻存液，90% 血清，10% DMSO，混匀。

3) 离心后去上清，将配制的冻存液加入，将细胞吹匀4) 取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 细胞冻存管中，做好标记和日期。

5) 放入装有异丙醇的冻存盒中，放入-80度冰箱过夜。

（冻存盒要提前一天从冰箱中拿至室温，使异丙醇的温度达到室温，每次冻存前确保异丙醇的加入量在刻度线上）。

6) 第二天将冻存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

1) 10cm 培养盘中加 10cm 新鲜 DMEM 培养基，放培养箱预热至 37℃。

2) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分钟左右）。

3) 待细胞冻存管中溶液尚未完全融化时加入预热的培养盘中。

4) 摇晃均匀，放培养箱培养。

5) 4h后待细胞完全贴壁后更换新鲜培养基（除去冻存液中DMSO 对细胞的毒害作用。

也可在第 3步中 800g 离心 5min，除去培养基后再悬浮细胞添加至新鲜预热的 DMEM 细胞培养皿中）。

1) 生物安全柜紫外灭菌半小时。

pAAV-hrGFP腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐hrGFP编号载体名称北京华越洋VECT10048 pAAV-‐hrGFPpAAV-‐hrGFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hrGFP， pAAV h rGFP, p AAVhrGFP质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV载体大小: 5.3 k b3‘ 端测序引物: Beta-‐globin-‐F：ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC 5‘ 端测序引物: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hrGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hrGFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。

腺病毒载体构建的基本原理与应用

腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。

在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。

通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。

本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。

2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。

选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。

2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。

质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。

通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。

2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。

这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。

2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。

转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。

2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。

最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。

3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。

以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。

通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。

•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。

腺病毒载体操作手册1407

腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。

1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2

连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

pLEX-MCS慢病毒载体使用说明

pLEX-MCS pLEX-MCS载体基本信息：载体名称:pLEXMCS, pLEX MCS, pLEX-MCS质粒类型: 哺乳动物细胞慢病毒表达载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 10682 bp5' 测序引物及序列: pLEX-MCS-FWD: CACCAAAATCAACGGGACTT3' 测序引物及序列: pLEX-MCS-REV: ATATAGACAAACGCACACCGGCCT 载体标签: --载体抗性: 氨苄/博来霉素(Zeocin)筛选标记: 嘌呤霉素(Puromycin)备注:稳定性: 稳定组成型: 诱导型病毒/非病毒: 慢病毒pLEX-MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息：pLEX-MCS载体简介：pLEX-MCS载体是慢病毒载体，带有一个多克隆位点。

pLEXMCS载体骨架是设计用来瞬转或稳转表达目的慢病毒，进而感染目的细胞系，导致你的目的基因过表达的载体。

pLEX-MCS载体拥有多个载体特征(具体见上文),这些载体特征使得载体能够有效进行过表达基因研究。

1.具有使用复制的非竞争性慢病毒转染或者转导的能力。

2.在体内和体外使用时都比较容易控制。

3.在进构建稳转细胞系的时候，可以使用嘌呤霉素进行筛选。

4.可以方便将任何目的基因导入到载体的多克隆位点处。

pLEX-MCS载体序列pLEX-MCS其他相关慢病毒载体：Tet-pLKO-neo Tet-pLKO-puro pPACKH1-GAGpMD2.G pCMV-dR8.2-dvpr pLKO.1-GFP-shRNA pLKO.1-TRC control pLKO.1-hygro pLKO.1-TRCpCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro FUW-tetO-hOKMSFUW-tetO-hOCT4 FUW-tetO-hSOX2 FUW-tetO-hKLF4FUW pLVX-AcGFP1-N1 pLVX-AcGFP1-C1pLVX-AmCyan1-N1 pLVX-DsRed-Express2-C1 pLVX-DsRed-Express2-N1 pLVX-DsRed-Monomer-N1 pLVX-PAmCherry-C1 pLVX-PAmCherry-N1pLVX-ZsGreen1-N1 pLVX-IRES-ZsGreen1 pLVX-IRES-mCherrypLVX-mCherry-C1 pLVX-mCherry-N1 pLVX-tdTomato-C1 pLKO.1-puro pLentilox 3.7 pLVX-Tet-On-Advanced pLVX-IRES-Puro pLVX-IRES-Neo pLVX-IRES-HygpLVX-EF1α-DsRed-Monomer-C1 pLVX-EF1α-AcGFP1-N1 pLVX-EF1α-AcGFP1-C1 pLVX-EF1α-mCherry-C1 pLVX-EF1α-IRES-mCherry pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1 pLVX-MetLuc Control pLVX-MetLuc pLVX-Hom-Mem1pLVX-Het-2 pLVX-DD-AcGFP1-Actin pPRIME-TET-GFP-FF3pSIH1-H1-CopGFP pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pLOX-CWBmi1 pLOX-CW-CREpRSV-rev pMDLg-pRRE pLL3.7pLVX-DD-AmCyan1 Control pLVX-DD-AmCyan1 Reporter pLVX-DD-tdTomato Reporter pLVX-DD-tdTomato Control pLVX-PTuner-Green pLVX-CherryPicker2pLVX-TetOne-Puro-Luc pLVX-TetOne pLVX-TetOne-PuropLVX-TetOne-Luc pLVX-rHom-Nuc1 pLVX-rHom-Sec1pLVX-rHom-1 pLVX-Hom-Nuc1 pLVX-Het-Nuc1pLVX-PTuner pLVX-PTuner2 pLVX-DD-ZsGreen1 Reporter pLVX-Het-1 pLVX-CherryPicker Control pLVX-Tet3GpCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-Hygro pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV pCDH1-MCS2-EF1-copGFP pCDF1-MCS2-EF1-Puro pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP pWPXL pLVX-TRE3G-ZsGreen1 pLVX-TRE3G-mCherry pLenti6.3-EmGFP-BveI miR pLenti6/V5-GW/lacZpLenti6.3/V5-GW/EmGFP pLenti6.3-MCS pLenti6.3-DsRed2-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP pLVX-shRNA2 psPAX2VSV-G pSico PGK Puro pcDNA6.2-DsRed2-MCS1 miR pcDNA6.3-EmGFP-NC- II pcDNA6.2-EmGFP-NC- I pcDNA6.2-EmGFP-BsaI miR pLenti6.3-BveI miR pLenti6.3-MCS-IRES2-DsRed2 pLEX-MCSpGIPZ pLP2 pLP1FUGW pFUGW pLOX-Ttag-iresTKpMDLg/pRRE pLentG-KOSM pCMV-dR8.91pLVX-TRE3G-Luc Control pLVX-TRE3G-IRES pCgpvpSico pSicoR pLVTHMpGensil-1 pLVX-EF1α-IRES-Puro pCDF1-MCS2-EF1-copGFP pPACKH1-REV pLVX-Het-Mem1 pLVX-shRNA1pLKO.1-puro-GFP-siRNA pPRIME-TREX-GFP-FF3 pcDNA6.2-DsRed2-BsmBI miR pCDH-MSCV-MCS-EF1-Puro pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP pLVX-TRE3GFUW-tetO-hMYC pLOX-TERT-iresTK pLP/VSVGFUW-M2rtTA pCDH-EF1-MCS-(PGK-Puro) pcDNA6.2-EmGFP-MCS1 miR pLVX-AmCyan1-C1 pLVX-Hom-1 pcDNA6.2-BsaI miRpLVX-DsRed-Monomer-C1 pLVX-mCherry-Actin pTRIPZpLVX-ZsGreen1-C1 pLVX-CherryPicker1 LeGO-iC2pLVX-IRES-tdTomato pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro pLKO.3GpLVX-tdTomato-N1 pLVX-PTuner2-C pLVX-PuropLVX-Tight-Puro pLVX-DD-ZsGreen1 Control pSicoR PGK PuropLVX-EF1α-DsRed-Monomer-N1 pCDH-UbC-MCS-EF1-Hygro pLVTHpLVX-EF1α-mCherry-N1 pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP。

pAAV-MCS腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐MCS编号载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C ATGGTGATG C GGTTTTGGC 541 A GTACATCAA T GGGCGTGGA T AGCGGTTTG A CTCACGGGG A TTTCCAAGT C TCCACCCCA 601 T TGACGTCAA T GGGAGTTTG T TTTGCACCA A AATCAACGG G ACTTTCCAA A ATGTCGTAA 661 C AACTCCGCC C CATTGACGC A AATGGGCGG T AGGCGTGTA C GGTGGGAGG T CTATATAAG 721 C AGAGCTCGT T TAGTGAACC G TCAGATCGC C TGGAGACGC C ATCCACGCT G TTTTGACCT 781 C CATAGAAGA C ACCGGGACC G ATCCAGCCT C CGCGGATTC G AATCCCGGC C GGGAACGGT 841 G CATTGGAAC G CGGATTCCC C GTGCCAAGA G TGACGTAAG T ACCGCCTAT A GAGTCTATA 901 G GCCCACAAA A AATGCTTTC T TCTTTTAAT A TACTTTTTT G TTTATCTTA T TTCTAATAC961 T TTCCCTAAT C TCTTTCTTT C AGGGCAATA A TGATACAAT G TATCATGCC T CTTTGCACC1021 A TTCTAAAGA A TAACAGTGA T AATTTCTGG G TTAAGGCAA T AGCAATATT T CTGCATATA 1081 A ATATTTCTG C ATATAAATT G TAACTGATG T AAGAGGTTT C ATATTGCTA A TAGCAGCTA 1141 C AATCCAGCT A CCATTCTGC T TTTATTTTA T GGTTGGGAT A AGGCTGGAT T ATTCTGAGT1201 C CAAGCTAGG C CCTTTTGCT A ATCATGTTC A TACCTCTTA T CTTCCTCCC A CAGCTCCTG1261 G GCAACGTGC T GGTCTGTGT G CTGGCCCAT C ACTTTGGCA A AGAATTGGG A 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pAAV-‐minCMV-‐mCherry。