原生质体融合育种
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
《原生质体融合育种》课件
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原生质体制备与融合 • 原生质体融合育种技术应用 • 原生质体融合育种的优势与挑战 • 案例分析
01
引言
定义与特点
定义
原生质体融合育种是一种通过将不同植物的原生质体进行融合， 以创造具有优良性状的新品种的育种方法。
特点
能够打破物种间的遗传限制，实现种间遗传物质的重组和转移， 加速新品种的培育。
酶活性的提高
通过原生质体融合技术， 将酶活性提高的基因导入 微生物中，提高微生物产 酶的效率和活性。
04
原生质体融合育种的优势与挑战
优势
高遗传改造潜力
高效基因导入
原生质体融合能够打破物种间的生殖隔离 ，实现基因在不同物种间的转移，从而创 造出具有优良性状的新品种。
通过原生质体融合，可以将多个优良性状 集中到一个新品种中，实现高效基因导入 。
抗病性改良
将抗病基因导入动物细胞中， 提高动物的抗病能力，减少疾 病的发生。
在微生物育种中的应用
01
02
03
高产菌株的选育
通过原生质体融合技术， 将高产菌株进行杂交育种 ，获得具有优良性状的高 产菌株。
抗菌抗药性改良
将抗菌或抗药基因导入微 生物中，提高微生物的抗 菌或抗药性，用于医药、 农业等领域。
遗传稳定性差
由于原生质体融合打破了物种的遗传 稳定性，因此新品种的遗传稳定性较 差，容易发生变异。
法规限制
原生质体融合涉及到伦理和法规问题 ，需要进行严格的伦理审查和法规限 制。
未来发展方向
提高技术水平
未来需要不断提高原生质体融合 的技术水平，提高融合效率和遗 传稳定性。
拓展应用领域
原生质体育种名词解释
原生质体育种名词解释
嘿，朋友们！今天咱来聊聊原生质体育种。
啥是原生质体育种呢？这就好比是给生物界来了一场奇妙的大改造！
想象一下，原生质体就像是一个小小的魔法盒子，里面装着生物的各种遗传秘密和潜力。
我们通过一些特别的手段，把不同生物的原生质体凑到一块儿，让它们发生奇妙的反应和融合。
这可不是随随便便就能做到的哦！得像个细心的工匠一样，精心地操作。
把不同的原生质体放在一起，就好像让不同的颜料混合，会产生出全新的色彩和效果。
比如说，我们可以把一种植物的原生质体和另一种植物的原生质体融合在一起，说不定就能培育出一种具有特殊性状的新植物呢！这多神奇呀！它能让植物变得更强壮、更能抵抗病虫害，或者长出更漂亮的花朵、结出更美味的果实。
这就好像搭积木一样，我们可以用不同的原生质体搭出各种各样我们想要的形状。
而且这个过程充满了惊喜和未知，你永远不知道会得到什么样的奇妙产物。
再想想，要是能把动物的原生质体也这么搞一搞，那会出现什么好玩的事情呢？会不会有能飞的鱼，或者会游泳的鸟呢？哈哈，虽然现在可能还做不到，但谁知道未来会怎样呢！
原生质体育种可不只是好玩哦，它对我们的生活有着实实在在的影
响。
通过它，我们可以培育出更好的农作物，让我们有更多更健康的食物吃。
还能让一些濒临灭绝的物种有机会重新焕发生机，这不是很棒吗？
总之，原生质体育种就像是打开了生物世界的一扇神奇大门，让我们有机会去探索和创造更多的可能。
它让我们看到了生物的无限潜力，也让我们对未来充满了期待。
难道不是吗？。
《原生质体育种》课件
化学诱变
使用化学诱变剂处理原生 质体，诱发基因突变，筛 选具有优良性状的新品种 。
细胞融合
将不同物种或同一物种不 同品系的原生质体进行融 合，以获得具有杂种优势 的新品种。
原生质体育种的应用
培育抗逆性强的新品种
改良作物的品质
通过原生质体育种技术，可以筛选出具有 较强抗逆性的新品种，如抗旱、抗寒、抗 盐碱等。
详细描述
物理法包括电融合、激光融合等，这些方法利用物理能量来诱导原生质体的融 合。化学法则是利用化学物质如聚乙二醇等诱导原生质体的融合。这些方法的 选择取决于实验条件和目的。
原生质体融合的应用
总结词
原生质体融合在植物育种、基因工程和生物技术等领 域有广泛的应用。
详细描述
在植物育种方面，原生质体融合可以用于创造新的植物 品种，通过将不同亲本的原生质体融合，可以产生具有 优良性状的杂种细胞，进而培育出新的植物品种。在基 因工程领域，原生质体融合可以用于基因转移和基因编 辑，通过将外源基因导入原生质体，可以实现基因的转 移和表达。此外，原生质体融合还可以用于研究细胞融 合的机制和细胞生物学特性，为生物技术的发展提供重 要的理论支持和实践经验。
现植物的遗传改良。
细胞融合
02
将不同植物的原生质体进行融合，创造新的植物品种或改良现
有品种。
细胞培养生产有用次生代谢产物
03
利用原生质体培养生产具有药用、工业或其他用途的次生代谢
产物。
02
原生质体融合
原生质体融合的定义
总结词
原生质体融合是将两种或多种植物细胞原生质体通过物理或化学方法融合，形成一个杂种细胞的技术 。
原生质体育种
目录
• 原生质体培养 • 原生质体融合 • 原生质体育种技术 • 原生质体育种的优势与挑战 • 原生质体育种案例分析
食用菌原生质体融合育种技术简介
食用菌原生质体融合育种技术简介原生质体（protoplast）这个术语最早是由Hanstein 在1880年提出来的。
确切地说，食用菌原生质体是指细胞壁完全消除后余下的那部分包裹的裸露的细胞结构。
原生质体虽然失去了细胞壁存在时的原有细胞形态，变成了圆球体，但它仍然具有原生质膜和整体基因组，是一个具有生理功能的单位。
食用菌原生质体融合（protoplastfusion）是指通脱壁后的不同遗传类型的食用菌菌株原生质体，在融合剂的诱导下进行融合，最终达到部分或者整套基因组（核基因、线粒体基、胞质基因）的交换和重组，生产出新的食用菌品种和类型，也就是说，食用菌原生质体融合育种技术上是一种不通过有性生活史（sexualcycle）而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。
近日，在佛山科技学院召开的“草菇原生质体融合育种研究”成果鉴定会上获悉，该院农学系利用现代生物工程原生质体融合育种技术，成功地选育出草菇新品种Ｖｐ—２、Ｖｐ—３。
专家们实地考察后认为，该研究成果数据可靠，技术新颖，品种表现良好，种性稳定，菌丝生长健壮，爬料速度快，抗杂能力强，子实体结实，基部紧凑，个体适中，兼备双亲优良性状，生物特性明显优于目前生产使用的当家品种。
鉴定专家一致认为，该研究成果居于国内领先水平。
据项目鉴定委员会主任、省微生物研究所研究员丘元盛介绍，该项目成果具有技术的前瞻性和研究的独创性：采用超声波处理结合溶壁酶酶解，很好地解决了草菇细胞壁裂解的难题，为原生质体融合育种提供了大量原生质体，完善了草菇原生质体制备和融合技术；创造性地利用不同草菇品种间存在拮抗作用进行融合子初筛，利用不同草菇种间分解脱脂牛奶、可溶性淀粉、聚半乳糖醛酸等物质的能力差异性，定量检测融合子与亲本间的酶分解能力，通过ＤＮＡ随机多态性差异检测进而确定融合子，技术操作新颖，为食用菌育种开辟新途径；开创性采用液氮研磨与溶壁酶酶解相结合提取草菇菌丝ＤＮＡ技术，获得高纯度遗传物质，圆满解决草菇等真菌ＤＮＡ提取过程中破壁困难和纯度不高等技术难题，实现现代分子生物学水平格测融合子的技术性飞跃。
原生质体融合育种
原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。
其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。
在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。
因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。
关键词原生质体制备融合育种原生质体再生融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。
当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。
原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。
[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。
[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。
1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。
常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。
其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。
[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。
去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。
[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。
丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。
[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。
原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用
原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用摘要原生质体融合技术是微生物遗传育种中的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。
文章从原生质体融合的特点以及融合技术应用等方面进行了综述。
关键词原生质体；原生质体融合；遗传育种’原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。
然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。
两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。
一、原生质体融合的特点1.杂交频率较高由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
2.受接合型或致育性的限制较小由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利不同种属间微生物的杂交。
另外，出于原生质体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制就比较小。
3.重组体种类较多由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触.有机会发生多次交换，可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体二、原生质体融合技术的应用在微生物育种中，常根据不同需求通过原生质体融合技术培育出优质、高产、抗逆性强等优点的微生物菌种。
1.标记菌株的筛选用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于重组体的检出。
常用营养缺陷型和抗性作为标记，也可以采用热致死，孢子颜色，菌落形态作为标记。
实际时究竟采用哪种遗传标记，要根据实验目的来确定。
原生质体融合育种
（二）原生质体融合的影响因素 １、融合剂 电场融合的优点： 适于动植物、微生物细胞；融合频率高 可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合 钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生 复原： 再生培养基 细胞壁重建 形成菌落 P239 图9.8
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母细胞壁结构和遗传标记 菌龄对原生质体形成影响大 亲本灭火的方法：紫外线
热 药物
第五节 酵母菌原生质体融合育种 一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节 霉菌原生质体融合育种 二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长 （3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种 三、原生质体转化育种 何种形式DNA转化率高？ 质粒
第一节 微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种 脂质体转移 原生质体转染等
第二节 微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原 生质体发生融合，并产生重组子的过程。
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。
下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。
2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。
3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。
二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。
2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。
3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。
总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。
第二节原生质体融合育种
第二节原生质体融合育种一. 原生质体融合育种的特点原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG) 助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生两套基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组体。
原生质体融合技术具有7 个方面的优点：杂交频率较高：由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时又加入了融合促进剂PEG ，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。
已知霉菌与放线菌的融合频率为10 -3 ～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10 -3 ～10-6。
受接合型或致育性的限制较小：由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。
另外，由于原生质体融合是和“性”没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制比较小。
重组体种类较多：由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触，可以有机会发生多次交换，所以可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体。
遗传物质的传递更为完整：由于原生质体融合是两个亲株的细胞质和细胞核进行类似合二为一的过程，因此遗传物质的交换更为完整。
原核微生物中可以得到将两个或更多个完整的基因组携带到一起的融合产物，放线菌中甚至能形成短暂或拟双倍体的融合产物，而在真菌中能形成短暂的或稳定的杂合二倍体甚至三倍体或四倍体等多倍体。
可获得性状优良的重组体：与其它的育种方法相结合，将从其它方法获得的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如，唐沢昌彦等将氨基酸生产菌AJ3419(AEC r+ile-)与Bl-4(AHV r +lys-) 的原生质体融合，获得了苏氨酸高产菌AJ11812(AEC r+AHV r+ile-+lys-) ，该菌的苏氨酸产量较亲株提高了1 倍。
《原生质体融合育种》课件
稻米和小麦的基因交换
细胞工程育种的应用
通过原生质体融合育种，实现稻 米和小麦遗传特性的交换， 以提 高两个农作物的产量和适应能力。
利用细胞工程技术和原生质体融 合，可以快速培育出抗性强、高 产优良品种。
植物基因编辑的进展
通过原生质体融合育种的细胞工 程技术，实现植物基因编辑， 能 够更精准地改良植物性状技术，将植物细胞分离并制备出原生质体。
2
随机融合和定向融合的区别
随机融合是将制备好的原生质体混合后融合，而定向融合是特定选择要融合的原生质 体进行融合。
3
影响融合效率的因素
原生质体浓度、温度、融合时间等因素会对融合效率产生重要影响。
应用案例
了解原生质体融合育种在农业和植物科学领域的具体应用案例。
优缺点
了解原生质体融合育种的优势、局限性以及未来发展方向。
原生质体融合育种的优点
快速获取新品种、遗传特性可控、有效提高农作物产量。
原生质体融合育种的缺点
融合效率低、变异性高、对环境的适应能力有限。
未来发展趋势
进一步改进原生质体融合育种技术，提高融合效率和品种稳定性。
结论
通过本课件的学习，我们了解了原生质体融合育种的基本原理、应用案例、优缺点以及未来发展趋势。 原生质体融合育种具有巨大的应用潜力，将助力农作物产量提升和遗传特性的改良。
《原生质体融合育种》PPT课 件
让我们一起了解原生质体融合育种的奥秘与应用。
介绍
原生质体融合育种是一种基因育种技术，通过将不同植物的原生质体融合，实现基因交流和遗传特性的 选择性增强。
什么是原生质体融合育种
原生质体融合育种是通过融合植物细胞的原生质体， 实现不同植物间基因的交流，以达到遗传性状 的改良。
原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用
原生质体融合技术及其在微生物育种中的应用摘要:原生质体融合技术是微生物遗传育种上的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，在菌种选育中具有广阔的应用前景。
本文从原生质体的制备及其影响因素、原生质体融合的促融方法、原生质体融合子的筛选以及融合技术在微生物菌种选育中的应用等方面进行了综述以及微生物原生质体融合技术的发展前景与展望。
关键词: 原生质体融合; 菌种选育; 生物技术; 应用发展前景与展望原生质体融合育种(proloplas} Iusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的B ars研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时口本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
1974年匈牙利的Fereczy采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Creolrichum carol irlrmv)营养缺陷型突变株原生质体的融合;随后人们相继用NaC1KCl和Ca(N03)2等作为诱变剂进行融合，但融合率比较低;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题，使这一技术迅速扩展到了育种领域;1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量的报告，从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用。
从此，原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌，并从株内、株间发展到种内、种间，打破种属间亲缘关系，实现属间、门间，甚至跨界融合。
1原生质体融合技术简介原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍---抢田胞壁，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。
原生质体融合育种
1、原生质体融合育种的特点
(1) 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件 下形
成类似于球形的原生质体。
2、原生质体融合育种步骤
1）标记菌株的筛选和稳定性验证。 2）原生质体制备。
3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。
4）涂布于再生培养基，再生出菌落。
5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融
合子进一步试验、保藏。 6）生产性能筛选。
3、原生质体融合育种的要点
（1）标记菌种的选择
获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛 选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要 的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还 可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功， 可以采用多标记菌种。
(2) 原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入 细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下 由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原 细胞的一切活性。
在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用 溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素 酶等。
影响原生质体制备的因素
• 菌体的前处理 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 • 菌体的培养时间 为使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期菌体。 • 酶浓度
(2) 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一 株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种 属间微生物的杂交。 (3) 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株 的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。
原生质体融合技术在马铃薯育种中的应用
原生质体融合技术在马铃薯育种中的应用原生质体融合技术是一种基因工程技术，可以将不同品种甚至不同属的植物原生质体融合，从而获得具有多种优良性状的杂种。
在马铃薯育种中，原生质体融合技术被广泛应用于基因转化、特定性状改良以及多倍体育种等方面。
1.基因转化。
利用原生质体融合技术，可以将具有抗病、抗旱、抗虫等优良性状的基因导入马铃薯，从而提高其抗逆性能。
这种技术不仅可以快速获取高抗性马铃薯，还可以避免传统育种中的基因杂交和后代筛选过程。
2.特定性状改良。
原生质体融合还可以通过将不同类型的马铃薯原生质体融合，获得具有多种特定性状的杂种。
例如，将高产量和耐旱性等性状融合在一起，可以获得既高产又抗旱的马铃薯品种。
3.多倍体育种。
原生质体融合技术还可以实现多倍体育种。
在马铃薯育种中，多倍体常常具有更大的叶片和块茎，更高的产量和抗逆性能。
因此，通过原生质体融合育种，可以获得更具发展前景的多倍体马铃薯品种。
总之，原生质体融合技术在马铃薯育种中的应用，可以提高马铃薯的抗病抗逆性能，改良特定性状，甚至获得更具发展前景的多倍体品种。
这种技术的应用将有助于加速马铃薯栽培的进程，提高马铃薯产量和品质，满足不断增长的全球食品需求。
优良菌种选育(原生质体融合)
洗涤菌体
酶解释放原生质体
洗涤菌体
酶解释放原生质体
分离纯化原生质体
分离纯化原生质体
AB原生质体等量混合
原生质体融合
再生
原生质体的融合方法
原生质体融 合方法
自发融合
融合概率低， 一般不推荐
诱导融合 激光诱导融合 电诱导融合
化学诱导融合
不需要仪器，操作 简单，但PEG对细胞 －16－ 有毒性，原生质体 融合率低 无毒无害，直观操作， 融合率较高，但需要在 专门的电融合仪
再生培养基
• • • 用MgSO4、甘露醇、山梨糖、蔗糖为渗透剂，不同的微 生物种类应选择不同的再生培养基。 营养因子，酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖类 原生质体保护剂扩张剂：牛血清白蛋白、人血清白蛋 白、明胶等对原生质体具有保护作用，同时起到原生 质体扩张剂作用，刺激原生质体再生。 加入再生细胞壁诱导物与前体物质：在培养基中加明 胶、细胞壁残片甚至纤维素都有刺激原生质体再生的 功能
纤维素酶 Cellulase
酵母裂解酶 Zymolyase β1,3葡聚糖酶
蜗牛酶 商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶
原生质体释放有关的因素
酶解时间：20min-7h左右，一般细菌酶解时间较短， 真菌酶解时间较长。 pH值：细菌如枯草芽孢杆菌最适pH7.5-8.5，低于 pH7对原生质体的制备率影响较大。真菌如黄青霉 菌最适pH为5.5，在pH值4.0-8.0范围内均可释放原 生质体。 预处理剂：青霉素，巯基乙醇，二硫苏糖醇 渗透压稳定剂：KCl，NaCl，CaCl2，MgSO4，蔗糖， 甘露糖，山梨醇。一般丝状真菌比较适宜以无机盐 为稳压剂，酵母菌则使用糖醇做稳压剂比较好。
食用菌生产技术 原生质体融合育种
原生质体在固体再生培养基和液体 再生培养基上均能再生，为了获得再生 单菌落，常采用固体再生培养基。
再生培养通常采用双层培养基培养 法，底层体纯化后，要进行适当的稀释， 用血球计数板准确计数每毫升原生质体 的数，然后根据实际再生菌落数，便可 计算出再生率。
原生质体再生率（％）＝
二、食用菌原生质体的基本特点
食用菌细胞外面包着一层坚硬的细胞 壁。这一道天然的“屏障”阻挡着食用 菌细胞间的彼此融合，并给各种遗传操 作带来极大困难。 游离的原生质体是真正的单细胞，在 同一时间内能得到大量的遗传上同质的 原生质体，为遗传学研究及用原生质体 为材料开展食用菌育种提供可能性。
原生质体具有以下几个特点：
原生质体的再生率与再生培养基成分、培养 方法、酶解时间及离心条件有关，一般随 着酶解时间的延长，原生质体的释放量增 多，但由于酶对原生质体膜的破坏作用， 再生率却有所下降。酶解时应以达到所需 原生质体的数量为宜。 较高的离心力及较长时间的离心，均 可引起原生质体的破裂，一般采用2000～ 5000r/min、5～10min的离心条件。
从菌丝体制备原生质体主要有两个优点：
①培养时间短，菌丝体生长均匀 一致，进而从菌丝体中释放的原生质 体，在生理和遗传特性上比较一致。 ②该材料在液体酶液中易分散， 适宜当前用酶解的方法分离原生质体。
由于不同食用菌菌丝生长速度不同， 获取幼龄菌丝体天数也不同。 选取旺盛生长期的菌丝体： 如草菇、银耳一般需要2～3天，平 菇需要3～4天，香菇需要5～6天，双孢 蘑菇需要7～9天，木耳则需要9～11天， 菌丝体培养一般采用液体静止培养法， 每瓶放十余粒玻璃珠，培养期间每天用 手摇1～3次
②间接检出法： 即将融合液涂布在营养丰富的再生 平板上，使亲本菌株和重组子都能再生， 然后，再施加选择因子检出重组子。 间接法虽然费时，但它可以克服某 些有表型延迟作用的遗传标记因直接选 择而产生的干扰作用。
微生物原生质体融合
2. 建立最佳融合体系 3. 重组子分离模型
第二节 放线菌原生质体融合育种
一、放线菌细胞壁组成、结构及水解 (一) 细胞壁组成和结构：类似于G＋菌 (二) 细胞壁水解 1. 水解酶 2. 酶解环境条件
二、放线菌原生质体融合育种技术 (一) 培养基与溶液 (二) 菌体培养及预处理 (三) 原生质体制备 (四) 原生质体再生 (五) 原生质体融合与再生 (六) 融合体的检出
1. 利用营养缺陷型标记选择融合体
2. 利用抗药性选择融合体
3. 用灭活原生质体检出融合体
4. 利用荧光染色法选择融合体
5. 双亲对碳源利用不同而检出融合体
6. 融合体的其他选择方法
五、融合重组体检出与遗传特性分析
(一) 重组体的检出和鉴别的方法
1. 直接法
(二) 融合率
第三节 酵母菌原生质体融合育种
一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记 单细胞真核微生物
二、酵母菌原生质体融合育种技术 (一) 出发亲本菌株的筛选及单倍体分离 (二) 酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液 (三) 原生质体制备：蜗牛酶 (四) 原生质体再生 (五) 酵母菌原生质体融合 (六) 融合重组体鉴定与遗传分析
二、培养基及溶液 三、霉菌原生质体融合分关键步骤
(一) 霉菌原生质体制备：多种水解酶 (二) 原生质体再生 (三) 原生质体融合和再生 (四) 融合重组体分析与鉴定
植物体细胞杂交育种原理
植物体细胞杂交育种原理物体细胞杂交（Somatic hybridization）,又称原生质体融合（Protoplast fusion ）是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。
将植物细胞A与植物细胞B用纤维素酶和果胶酶处理，得到不含细胞壁的原生质体A和原生质体B，运用物理方法或是化学方法诱导融合，形成杂种细胞，再利用植物细胞培养技术将杂种细胞培养成杂种植物体。
①杂交时间：植物细胞杂交是从细胞融合开始，到培育成的新植物体结束。
a.原生质体制备：用酶解法去除细胞壁（纤维素酶和果胶酶）b.原生质体融合：膜融合（高钙、高pH诱导融合）、核融合（杂种细胞第一次有丝分裂时融合）原生质体的融合细胞分裂与染色体丢失如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。
如果这样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细胞＋B细胞质和部分染色体或基因。
2．基因转移与性状表达由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合，其结果是实现了亲本间的基因转移。
基因转移通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。
3．体细胞杂种遗传上的不稳定性体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的重组等。
②优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，扩大杂交亲本范围，培育新优良品种。
③举例：“白菜-甘蓝”同白菜相比，具有生长期短，耐热性强，和易储藏等优点。
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Microbe B
ADD ENZYME
Microbe A
ADD FUSION PROMOTER
原生质体融合
融合后再生
原 生 质 体 融 合 后 基 因 重 组
与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势
➢ 大幅度提高亲本之间重组频率。 ➢ 扩大重组的亲本范围。 ➢ 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传
此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大 步。 c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后 所出现的产量上升缓慢的现象。 d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，
一、直接亲本及其遗传标记的选择
➢ 原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传 差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更 大的杂种优势。
一、直接亲本及其遗传标记的选择
作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传标 记，便于重组体的检出。
常用遗传标记： （何谓“遗传标记”） ✓ 营养缺陷 ✓ 抗性 ✓ 热致死（灭活） ✓ 孢子颜色 ✓ 菌落形态
2.原生质体的鉴定
➢ (2)荧光染色法：原生质体混悬液用荧光增白剂（VBL）染 色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原 生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。 （区别 细胞壁与细胞膜的不同）
3.原生质体的收集和纯化
纯化方法有以下几种（这些方法基于什么原理？）
✓ (1)过滤法 ✓ (2)密度梯度离心法 ✓ (3)界面法 ✓ (4)漂浮法
（一）原生质体制备
制备大量具有活性的原生质体是微生物原 生质体融合育种的前提。
1.原生质体制备方法
机械法、非酶分离法和酶法。 采用前两种方法制备的原生质体效果差，
活性低，仅适用于某些特定菌株。 最有效和最常用的是酶法。该法时间短，
效果好。
Protoplast fusion
Protoplast fusion allows genetic improvement (random mutation & recombination) of asexual micro-organisms
物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状 机会更大。
不足之处
➢ 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加 重组体分离筛选的难度。
➢ 细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗 传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的 重组频率，使远缘融合杂交存在较大困难。
第3节 原生质体融合育种的步骤
一、直接亲本及其遗传标记的选择 二、原生质体制备与再生 三、原生质体融合 四、融合体再生与检出 五、重组体检出鉴别与遗传特性分析
在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。
4.原生质体的活力鉴定
分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材 料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。
(3)界面法
原理：选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原 生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离心后 原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。
原生质体
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
(4)漂浮法
适用于一些细胞较大的微生物。 原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能
热致死（灭活）
A
B
把双亲中任何一方的原生质体用热灭
活（如50℃，2h或60℃，5 min)或用
灭活
正常活性
紫外线、药物灭活，使细胞内的某些
酶或代谢途径钝化（核酸不变性），
然后和另一方具有正常活性的原生质
体融合而获得重组体。
采用灭活标记融合频率较低，但重组
无活性 正常活性 正常活性
体产量较高。
二、原生质体制备与再生
不能克服远源杂交不亲和的障碍。
微生物杂交的方式
原核： 接合 原生质体融合
真核： 有性杂交 准性杂交 原生质体融合
第2节 原生质体融合育种
原生质体:脱去细胞壁的植物、真菌或细菌 细胞。
原生质体融合
原生质体融合（protoplast fusion）是20世纪70年代发展起 来的育种技术。
用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由 原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法， 诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、 重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一 体的稳定融合子。
本节重点
原生质体融合亲本及其遗传标记的选择 原生质体制备 原生质体融合 检出融合体的方法
本节难点
融合体和重组体的检出及鉴别的方法 提高重组效率的方法
第1节 微生物杂交育种
• 概念：杂交育种通过微生物杂交将不同菌 株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌 株的优良特性集中于一个重组体中。
甲
生长快、产量低
乙 生长慢、产量高
杂交
生长快、产量高
应用
面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快；
酒精酵母:产酒率高，而对麦芽糖、葡萄糖的发酵 力弱
杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体
用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。
杂交育种的优点：
a) 可将两个或多个优良性状集中在一个个体上。 b) 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因
通常采用离心法。
(1)过滤法
根据细胞大小，选用孔 径略小于细胞的砂芯漏 斗，过滤。
原生质体由于外层细胞 膜柔软可变形，可以由 比它小的微孔中穿过， 而未酶解细胞或细胞团 却不能。
(2)密度梯度离心法
用蔗糖或氯化铯等制成浓度 （密度）梯度溶液，由于密 原生质体 度差别，经离心后原生质体 漂浮于上部，未酶解细胞和 细胞碎片、 细胞碎片沉于溶液下部。 未酶解细胞
protoplasts preparation: cells are grown in isotonic solution while
inhibiting growth of cell wall, and partly dissociation it (lysozyme)
2.原生质体的鉴定
➢ (1)低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在 低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。