原生质体融合育种

(3)界面法
原理：选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原 生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离心后 原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。
原生质体
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
(4)漂浮法
适用于一些细胞较大的微生物。 原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能
物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状 机会更大。
不足之处
➢ 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加 重组体分离筛选的难度。
➢ 细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗 传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的 重组频率，使远缘融合杂交存在较大困难。
第3节 原生质体融合育种的步骤
一、直接亲本及其遗传标记的选择 二、原生质体制备与再生 三、原生质体融合 四、融合体再生与检出 五、重组体检出鉴别与遗传特性分析
一、直接亲本及其遗传标记的选择
➢ 原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传 差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更 大的杂种优势。
一、直接亲本及其遗传标记的选择
作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传标 记，便于重组体的检出。
常用遗传标记： （何谓“遗传标记”） ✓ 营养缺陷 ✓ 抗性 ✓ 热致死（灭活） ✓ 孢子颜色 ✓ 菌落形态
不能克服远源杂交不亲和的障碍。
微生物杂交的方式
原核： 接合 原生质体融合
真核： 有性杂交 准性杂交 原生质体融合
第2节 原生质体融合育种
原生质体:脱去细胞壁的植物、真菌或细菌 细胞。
原生质体融合
原生质体融合（protoplast fusion）是20世纪70年代发展起 来的育种技术。
用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由 原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法， 诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、 重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一 体的稳定融合子。
在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。
4.原生质体的活力鉴定
分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材 料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。
热致死（灭活）
A
B
把双亲中任何一方的原生质体用热灭
活（如50℃，2h或60℃，5 min)或用
灭活
正常活性
紫外线、药物灭活，使细胞内的某些
酶或代谢途径钝化（核酸不变性），
然后和另一方具有正常活性的原生质
体融合而获得重组体。
采用灭活标记融合频率较低，但重组
无活性 正常活性 正常活性
体产量较高。
二、原生质体制备与再生
（一）原生质体制备
制备大量具有活性的原生质体是微生物原 生质体融合育种的前提。
1.原生质体制备方法
机械法、非酶分离法和酶法。 采用前两种方法制备的原生质体效果差，
活性低，仅适用于某些特定菌株。 最有效和最常用的是酶法。该法时间短，
效果好。
Protoplast fusion
Protoplast fusion allows genetic improvement (random mutation & recombination) of asexual micro-organisms
protoplasts preparation: cells are grown in isotonic solution while
inhibiting growth of cell wall, and partly dissociation it (lysozyme)
2.原生质体的鉴定
➢ (1)低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在 低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。
此，不论在方向性还是自觉性方面，均比诱变育种前进了一大 步。 c) 利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后 所出现的产量上升缓慢的现象。 d) 杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和促进 遗传学理论的发展。
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杂交育种缺陷：
a) 只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因； b) 杂交进程缓慢，过程繁琐，育种时间长； c) 只能进行本物种或亲缘关系较近的物种杂交，
Microbe B
ADD ENZYME
Microbe A
ADD FUSION PROMOTER
原生质体融合
融合后再生
原 生 质 体 融 合 后 基 因 重 组
与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势
➢ 大幅度提高亲本之间重组频率。 ➢ 扩大重组的亲本范围。 ➢ 原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传
通常采用离心法。
(1)过滤法
根据细胞大小，选用孔 径略小于细胞的砂芯漏 斗，过滤。
原生质体由于外层细胞 膜柔软可变形，可以由 比它小的微孔中穿过， 而未酶解细胞或细胞团 却不能。
(2)密度梯度离心法
用蔗糖或氯化铯等制成浓度 （密度）梯度溶液，由于密 原生质体 度差别，经离心后原生质体 漂浮于上部，未酶解细胞和 细胞碎片、 细胞碎片沉于溶液下部。 未酶解细胞
本节重点
原生质体融合亲本及其遗传标记的选择 原生质体制备 原生质体融合 检出融合体的方法
本节难点
融合体和重组体的检出及鉴别的方法 提高重组效率的方法
第1节 微生物杂交育种
• 概念：杂交育种通过微生物杂交将不同菌 株的遗传物质进行交换、重组，使不同菌 株的优良特性集中于一个重组体中。
甲
2.原生质体的鉴定
➢ (2)荧光染色法：原生质体混悬液用荧光增白剂（VBL）染 色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原 生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。 （区别 细胞壁与细胞膜的不同）
3.原生质体的收集和纯化
纯化方法有以下几种（这些方法基于什么原理？）
✓ (1)过滤法 ✓ (2)密度梯度离心法 ✓ (3)界面法 ✓ (4)漂浮法
生长快、产量低
乙 生长慢、产量高
杂交
生长快、产量高
应用
面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快；
酒精酵母:产酒率高，而对麦芽糖、葡萄糖的发酵 力弱
杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体
用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。
杂交育种的优点：
a) 可将两个或多个优良性状集中在一个个体上。 b) 由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因