排阻色谱法

（二）排阻色谱不适用范围
1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝 胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的 分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒 内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离 效果。
两种排阻色谱类型比较
凝胶渗透色谱（GPC） 凝胶过滤色谱（GFC）
排阻色谱法
一、简 介
（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography， SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称 为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液 相色谱的一种。
（二）分类：
一般用于分离水溶性的大分子，凝 胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂
（2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的
相对分子质量范围。
（3）溶胀率：
某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要
用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分 率称为溶胀率，即
溶胀率
（溶胀处理平衡后重量
缺点
质脆易碎，柱子装填不紧，柱 选择性低，料液处理量小，洗
效低。
脱后产品被稀释
三、固定相与流动相
流动相的选择
• 必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝 胶。
• 溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。 • 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水
等。
固定相——凝胶：一种经过交联而具有立体网状结构的 多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
干燥重量
干燥重量） 100%
（4）Байду номын сангаас胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分 离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150m，硬凝胶粒径 较小，一般为5～50m。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
（6）孔隙体积（void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积，即V0值。孔隙体积 可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
2、葡聚糖凝胶LH-20：是葡聚糖凝胶G-25分子中引入羟丙基 以代替羟基的氢，成醚键结合状态，因而具备了一定的亲脂 性，适用于分离黄酮、色素等有机物。
3、无机凝胶：无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃，机 械性能好，选择性高。但其吸附性较大，处理极性大的样品 需注意。
凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
分类：
1、按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
2、按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、 非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
四、凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
（一）葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡聚糖和交联剂甘油 通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
葡聚糖凝胶的立体网状结构
由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性 溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不 活泼性，故具有较高的稳定性。
交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质 的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子 物质的分离。
（二）聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰 胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加 工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
（三）琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网 状结构。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多 条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝 胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭 菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。
（四）亲脂性凝胶
亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。 1、聚苯乙烯凝胶：应用范围广，由苯乙烯和二乙烯苯聚合 而成。机械性能好，孔隙分布比较宽，多应用于合成高分子 材料的分离和分析。
流动相
采用水溶液或缓冲液作为流动 相
采用有机溶剂作为流动相
常用分析物质
分析高聚物的摩尔质量，如： 聚乙烯、聚氯乙烯等
多肽、蛋白质、核酸、多糖等
常用凝胶
交联聚苯乙烯凝胶
葡萄糖系列
优点
操作简便，进样量小，重现性 好，自动化程度高
条件温和，产品回收率近100%， 易实施循环操作，提高产品纯 度，分析速度快，精度高，分 离机理简单，操作参数少。
4、样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小 体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.010.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
六、应 用
（大分子）分子量的测定 （大分子）分子量分布的测定 （中小分子）有机物的定量分析 生物大分子纯化 指纹图谱（原油及其重质组分的评价） 样品净化（预处理）
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比 是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱， 其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长
排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，一般柱长 60-120cm对于蛋白质的分离比较理想，而30cm的柱子多 用于快速分离。
3、流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。 如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.51.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
凝胶的选择
良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用；
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试 剂中保持稳定，使用寿命长；
（3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
五、影响分离特性的因素
1、填料
凝胶过滤色谱法-GF主C主要要是用水于。有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量
凝胶渗透色谱法-GPC分胶布，分洗析脱及溶分剂离为，四常氢用呋的喃凝等胶有为机交溶联剂聚。苯乙烯凝
二、基本原理
(一) 分子筛效应
凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构 上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。分子量大小不同的 多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表 现分子筛效应。