基因工程：第四章2

4.2.5 常用λ噬菌体载体

1.Charon载体

* Charon 16A：是一种插入型载体，它的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）上有一个EcoR I切点，插入外源DNA片段后，lacZ基因失活，在补加有IPTG和X-gal的培养平板上形成无色噬菌斑，很易检出。该载体一般可容纳10 kb的外源DNA片段。* Charon 4：是一种替换型载体，它的可被外源DNA取代的EcoR I片段中包含大肠杆菌的lac5区段，其上有lacZ基因，以及它的操纵基因和启动基因。该EcoR I片段被取代后的载体感染lac-指示菌，只能产生无色的噬菌斑。该载体可容纳23 kb的外源DNA片段。

* Charon 28：是一种替换型载体，它的可取代区段两端各有一个BamH I切点，内部有red和gam基因，并且自身不含chi位点。当外源DNA取代该片段后，就成为red-gam-，这样的噬菌体突变体获得了Spi-表型，能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长，形成噬菌斑。该载体可用于克隆Sau 3A部分消化的DNA 片段，容量可达20 kb。

2.EMBL系列载体

是一类替换型载体，适用于克隆长度为8~23 kb（几乎接近理论值）的外源DNA片段，常用作基因组文库的构建。

在λEMBL3和λEMBL4的可取代区段的两侧，各有一段切点相同、方向相反的多克隆位点，可被EcoR I、BamH I和Sal I所识别，因而可以用来克隆由这三类限制酶所产生的任何一种限制片段。

其中BamH I切点还可以连接经Sau 3A或Mbo I部分消化的DNA片段（因为它们产生的粘性末端完全一样，都是GA TC），虽然在克隆过程中载体上的BamH I位点被破坏了，但可以选用EcoR I或Sal I作消化作用，便能回收到克隆的外源DNA片段。

3.λgt系列载体

是一类插入型载体，常用于构建cDNA文库。

* λgt10：长度为43 kb，用于克隆小于6 kb的EcoR I切割片段。EcoR I的单一切点位于cI基因内，该位点插入外源DNA片段后使cI基因失活，产生的重组噬菌体形成清晰的噬菌斑，有利于重组体的筛选。

* λgt11：长度为43.7 kb，用于克隆小于7.2 kb的EcoR I切割片段。EcoR I的单一切点位于lacZ基因的近羧基端，该位点插入失活的重组噬菌体在IPTG和X-gal 平板上形成无色噬菌斑，很容易筛选。

λgt11的S基因含有琥珀突变（Sam100），在SupF（琥珀突变抑制基因）宿主菌内能正常增殖，在非抑制性宿主菌内，Sam100突变的噬菌体不能裂解细菌，从而使表达的融合蛋白在细胞内积累。

λgt11的cI857基因产生的λ阻遏蛋白是热不稳定的，在32℃时，有功能的λ阻遏蛋白使噬菌体倾向于溶源生长，宿主菌不发生裂解；42℃时，λ阻遏蛋白失活，噬菌体使宿主菌裂解。

* λgt22和λgt23：基本保留了λgt11的特点，不同的是λgt22和λgt23位于lacZ基因上的多克隆位点是由5个单一切点组成的，即Not I、Xba I、Sac I、Sal I和EcoR I。由于真核DNA中Not I和Sal I位点很少，所以使用这两种酶进行克隆能显著增加获得全长cDNA的机率。

Not I：GC↓GGCCGC

Sal I：G↓TCGAC

λgt22和λgt23之间的差别是多克隆位点的方向正好相反。

4.3 柯斯质粒载体（cosmid vector）

是一类由人工构建的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，也称粘粒载体。

4.3.1 柯斯质粒载体的组成与特点

1. 组成：

(1)一个质粒的复制起始部位和一个抗药性标记

(2)一个或多个限制酶的单一位点

(3)一个带有λ噬菌体cos位点的片段

(4)分子量小（4~6 kb），可容纳的真核DNA 达45 kb

柯斯质粒pHC 79兼备了λ噬菌体载体和pBR 322质粒载体两方面的优点：

来自pBR 322质粒部分的是一个完整的复制子，编码着一个复制起点和两个抗菌素抗性基因Amp R和Tet R。

来自λ DNA部分的片段，除了提供了cos位点外，在cos位点两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列，这样它能够包装成具有感染性的噬菌体颗粒。

2. 特点：

(1)具有λ噬菌体的特性：柯斯质粒载体连接适宜长度的外源DNA片段后，可在

体外包装成噬菌体颗粒，并能高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。但由于其不含有λ噬菌体的全部基因，故不能通过溶菌周期，也不能形成子代噬菌体颗粒。

(2)具有质粒载体的特性：能象质粒DNA一样在寄主细胞内复制，也能在氯霉

素作用下进行扩增。通常都具有抗菌素抗性基因，有些还带有基因插入失活的克隆位点，为重组体的筛选提供了方便的标记。

(3)具有高容量的克隆能力：λ噬菌体载体的克隆容量理论极限值是23 kb，一般

为15 kb左右，而cosmid载体的克隆极限可达45 kb左右。这是因为cosmid 载体本身比较小，一般低于5 kb，这样插入一个45 kb的外源DNA片段，不

影响λ噬菌体地包装。另一方面，由于包装限制的缘故，cosmid的克隆能力还有一个最低极限值，对于5 kb的cosmid载体，插入的外源DNA片段至少达到30 kb，才能包装成为具有感染性的λ噬菌体颗粒。因此cosmid载体克隆大片段的DNA分子特别有效。

4.3.2 柯斯质粒载体中的克隆

λ噬菌体具有一种位点特异的切割体系，叫做末端酶或Ter体系，它能识别两个相距适宜的cos位点，把多连体分子切割成λ单位长度的片段，并把它们包装到λ噬菌体头部中去。可以看出，Ter体系要求被包装的DNA片段具有两个cos位点，在这两个cos位点之间要保持36~52 kb的距离，这对于柯斯质粒克隆外源基因，进行体外包装是非常重要的。

1. 一般程序：

2. 在经两种限制酶消化的粘粒中进行克隆