一代测序规范操作规范

P C R产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备

（一）实验试剂

（二）、实验耗材

二、实验仪器

三、实验操作具体步骤

（一）核酸的提取

按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。

（二）测序PCR模板的制备

（1）、预先制备适量冰

（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix

（3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上

（4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序

95℃5min→

（95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→

（95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→

72℃ 7min→4℃ Forever

（5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。

（6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：

（三）、纯化后的PCR产物的测序反应

1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当增大稀释倍数）

2、测序反应用引物稀释到1μM

（1）PCR产物测序反应体系（10μl）：

PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表：

DNA纯度：OD260/OD280=1.6~1.8；DNA含量（ng/μl）=OD260×50

BigDye（2.5x）稀释10倍配方：

（2）测序PCR循环条件：

一般测序：

96 °C 1 min →

(96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25循环→

4 °C保温

大分子测序：

95 °C 5 min →

(96 °C 30 sec → 50-55 °C 10 sec → 60 °C 4 min) x 50循环→

4 °C保温

（三）测序反应产物纯化（酒精/EDTA法）：

1、96孔板纯化方法：

（1）每管加入2.5μL 125 mM EDTA(pH=8)，加到管底；

（2）加入30 μL 100% 酒精，封严，震荡4次，室温放置15 min；

20°C最大转速离心45min，马上倒置96孔板，倒置最小转速离心10s；

（3）加入60 μL 70% 酒精，最大转速4 °C离心15 min，马上倒置96孔板，最小转速离心1 min ；

（4）70%酒精重复洗涤1次或2次；

（5）让残余的酒精在室温挥发干，加入10 μL Hi-Di甲酰胺，95 °C变性4 min，迅速置冰上4 min ，上样电泳。

2、单个0.2 mL离心管离心方法：

（1）每孔加入2.5μL 125mM EDTA到溶液中，再加入30μL 100%酒精，盖好，震荡4次，室温15 min。

（2）台式离心机12000 x g 离心30 min，马上用枪吸尽上清液。

（3）每孔加入60 μL 70% 酒精，12000 x g 4°C离心15 min，马上用枪吸尽上清液。此步可以重复1次。

（4）让酒精在室温挥发干净，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。

（5）在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机电泳。

一般常见的纯化方式有三种：

（1）酒精/EDTA 沉淀法：利用EDTA 螯合定序反应中的Mg2+离子，再加入酒精，经离心后使定序产物小片段沉淀，游离的荧光物质则悬浮于上清液中，小心地将上清液除去，再经过一次的酒精清洗沉淀物，则可以完全去除游离的荧光物质。此法的优点是可以将游离的荧光物质去除的非常干净，几乎完全没有背景值会影响序列判读，然而，其缺点是无法保留小分子量的片段，约第20个碱基开始才可以被读取出来。

（2）酒精/EDTA/醋酸钠沉淀法：利用EDTA 螯合定序反应中的Mg2+离子，再依序加入醋酸钠（帮助沉淀）、酒精，经离心后使定序产物小片段沉淀，游离的荧光物质则悬浮于上清液中，小心地将上清液除去，再经过一次的酒精清洗沉淀物，则可以去除游离的荧光物质。此法的优点是可以保留住极小分子量的片段，使第一个碱基就可以被读取出来，然而，其缺点是无法完全去除游离的荧光物质，会有较高的背景值影响序列判读。

（3）离心管柱纯化法：使用特殊的gel-filter，将定序反应产物小心地注入其中，经过低速离心，游离的荧光物会保留在gel 中，流出液则完全不含游离的荧光物。此法的优点是结合前面两种方法的优点--既可以读取到第一个碱基，背景值也完全被清除干净，也相当省时（只需7 分钟，前面2 种方法约需1 小时），然而，其缺点是昂贵。