乳酸菌培养及诱导培养基

嗜酸乳杆菌试验方法

一株嗜酸乳杆菌产共轭亚油酸条件的优化[J]. 中国酿造，2009

1、基础培养基(脱脂乳培养基)

12.0 g脱脂奶粉，蒸馏水100 mL，pH自然，115℃灭菌20 min。

2、MRS固体培养基

葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g，

无水乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，

MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.33g，

琼脂15g，pH 6.8左右，加蒸馏水至1000mL，121℃灭菌20min。

3、产酶培养基：

脱脂乳培养基，并加入一定浓度的亚油酸来诱导产酶。

1 出发菌株的活化及纯化

保藏的嗜酸乳杆菌接种于液体MRS培养基，摇匀后置36℃恒温箱中培养12h，接种于液体培养基中活化2次。划线接种到MRS固体培养基，36℃恒温培

养36h，嗜酸乳杆菌在120r／min的状态下培养有利于嗜酸乳杆菌的繁殖*。长出单个菌落后，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，确定是否纯种。

嗜酸乳杆菌的形态与菌落特征

在MRS琼脂培养基上需氧培养48h后，菌落微小，不规则，微隆起，有光泽，灰白色，呈透明的玻璃霜花样。10倍显微镜观察表面凸凹不平，边缘为丝状或卷发样。革兰氏染色后可见菌体呈短杆状，单个或短链状排列，革兰氏染色阳性。肉眼观察，嗜酸乳杆菌菌落较小,平台状，不规则、圆形凸起、边缘整齐、质地柔软、灰白色、有光泽。

1）500mL MRS液体培养基

2）5个250mL的三角瓶，橡胶塞，牛皮纸，绳子

3）5个培养皿

4）1个接种环，酒精灯，打火机，酒精

2 种子的制备

活化的菌种接种于基础培养基，于36℃恒温培养24 h，保藏备用。

增菌培养基最佳接种量为3%（活菌数为108个/mL）★

3 产酶诱导培养

用脱脂乳配成12%的产酶液体培养基，每250mL三角瓶中装入100mL(含12g脱脂乳、1.50‰亚油酸)，加入1mL吐温80，115℃灭菌30 min后，接入2 mL 种子液(每mL含菌体5×108个)，36℃培养36h。▲

100mL 三角瓶装40mL的脱脂乳(含4.8g脱脂乳、1.50‰亚油酸)，将活化后的菌种按3%接种（接种量为1.2mL），混匀，在36℃下静止培养36h。并添加0.1%(m/v)的乳糖，0.1%的硫酸铵，0.1%的氯化钠。

1）5个100mL的三角瓶

第一次

直接添加LA比较好，且LA添加量为 1.50‰

反应温度为36℃

发酵时间为36h

第二次（回归正交）每个试样平行3次。

（菌种接种量2%、3%、4%、5%、6%）

（发酵时间为12h、24h、36h、48h）

（D-果糖添加量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)）

果糖为产CLA的最佳碳源

（硫酸铵添加量0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)）

结合有机物牛肉膏更有利于乳酸菌的生长，CLA产量也最高。硫酸铵的添加量增加CLA产量反而有所减少。铵离子被吸收会导致培养基的pH下降不利于CLA 的产生。※

※于国萍，寇秀颖. 产共轭亚油酸乳酸菌的选育及培养基的确定[J]. 食品工业科技, 2005,26(5):60～62.

（氯化钠添加量0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%(m/v)）

（直接添加LA比较好，且LA添加量为0.50‰、1.00‰、1.50‰、2.00‰(v/v)）（反应温度为25℃、30℃、36℃、40℃）

（发酵时间为12h、24h、36h、48h）

考察菌体接种量、亚油酸(LA)的添加量、反应温度等因素对菌株嗜酸乳杆菌转化培养条件的影响。

4 分离纯化

培养结束后离心高速冷冻离心机(6000r/m，10min，4℃)收集菌体细胞。用蒸馏水洗涤2次，离心后称重，及得生物量。离心后加入4倍体积的pH4.0的缓冲液混匀，以0.5%(m/v)的量添加溶菌酶(30℃保温，1h)，然后再使用超声波细胞破碎仪(超声3s，间歇4s，90次，400W)在冰水浴中进行细胞破碎。破碎完成后进行离心(8000r/m，10min，4℃)，所得上清液及为粗酶液。粗酶液的合成反应

取上述制取粗酶液5mL加2mLLA乳浊液底物(5% LA+5% Tween80+90% pH4.0缓冲液，放入冰水浴中超声10min，功率400w)，放在摇床中30℃，120r/min反应3h。反应结束后，待测。

5 共轭亚油酸的检测

脂肪酸的提取

反应后的溶液中加入5ml正己烷，充分震荡萃取，静置后待分层，收集上清液，在正己烷溶液中加如无水NH3SO4吸水干燥。与30℃旋转蒸发，去除有机溶剂，将余下的液体收集在试管中待测。

GC-MS检测共轭亚油酸

以未接入菌种、其他步骤和条件同上的情况下所得到的正己烷萃取液为参比、正己烷为溶剂，于波长200nm～300nm处扫描样品，观察波长233nm处有无特征吸收峰。若在该波长处有特征吸收峰者，表明其发酵液中有CLA生成，读取波长234nm处吸光度值，根据CLA标准曲线所得CLA浓度，计算发酵液中CLA的生成量。

用UV-1600可见紫外分光光度计在190nm～300nm对共轭亚油酸进行波长扫描，以确定其最大的吸收波长。其波长扫描图如图 2.1，得其最大吸收波长233nm。

图2.1 CLA最大吸收波长扫描图

Fig.2.1 Absorption wave maximum of CLA

* 张智，余萍. 嗜酸乳杆菌的筛选及培养基的优化[J]. 中国乳品工业, 2007, 35(6)：25～27.

★陈洪仪，杨楠. 嗜酸乳杆菌培养的研究[J]. 现代食品科技, 2009, 25(6)：656～660.

▲张浩，曹健，张国艳. 保加利亚乳杆菌中德亚油酸异构酶的研究[J]. 食品研究与开发, 2006, 127(7)：102～107.