真菌淀粉酶的发酵及特性

真菌淀粉酶的发酵及特性

筛选来自不同种子中的曲霉属真菌，用来研究它们产淀粉酶的能力。一种被选出的菌种曲霉属真菌JGI12在固体发酵培养中显示出了最高的酶活力。筛选不同的培养基用于产酶。结果发现椰子油滤饼，花生油滤饼和米糠培养基对于菌种JGI12的产酶效果较好。不同的组合：小麦麸皮培养基：花生油滤饼培养基：米糠培养基（1：2：2）是菌种有更高的产酶量。这种培养基将被用于淀粉酶的生产与特性观察。此外发现产生的淀粉酶具有耐热性并且适宜生长的pH值范围较大。

介绍：近些年，用微生物作为原料提取工业生产相关的淀粉酶的巨大潜能已经激起了各个微生物研究领域科学家的研究兴趣。淀粉酶是是淀粉在工业生产中，多糖水解的重要酶类，其可以将淀粉水解为单糖成分。尽管淀粉酶可以从不同的原料中获取，例如植物，动物，而从微生物中分离出的淀粉酶却普遍更能满足工业生产的要求。在淀粉加工工业中，微生物淀粉酶已经成功的取代了化学水解淀粉的过程。此外，还有在食品，陪考，酿造，清洁剂，纺织品和造纸等工业生产中的应用潜能。随着生物技术新疆界的出现，淀粉酶光谱应用已经扩大到很多其他的领域：例如医学临床试验，药物试验和分析化学等。

这篇文章的目标是：为淀粉酶的提取选择合适的菌种，筛选不同的农副产品培养基，使菌种的产酶量达到最大。将这些培养基间进行不同的组合，优化培养基的条件，使淀粉酶的产酶量达到最大。

材料与方法

微生物的分离

从来自不同地区的不同种子中分离出几种黄曲霉属真菌。根据形态学特征，将它们鉴别出来。

筛选与分离

初选是通过淀粉琼脂平板完成的。分离出的黄曲霉属真菌JGI12呈现出了最大的水解圈。用这种方法被选出的菌种JGI12作为后续研究的菌种。

培养基

小麦麸皮，黑绿豆和米糠菌取自印度的芒格洛尔似的米尔斯。椰子油滤饼，花生油滤饼，芝麻油滤饼和玉米棒均取自印度的班加罗尔市。培养基的制备是用搅拌机将原料研磨成粗粉状。

固体发酵

在淀粉酶的发酵生产中，真菌要在盛有5g粗粉培养基的250mL锥形瓶中25℃培养。此过程中要用蒸馏水来调整培养液中的水分含量从43%到81%。

最佳培养条件

通过对比小麦麸皮培养基和其他的培养基，1：1的比率被采纳。基于培养条件的对照，两种其他培养基的组合比率也被采用。为了确定培养条件的效果，目前的研究已经采用了不同的发酵周期（4,5,6,7,8和9天），不同的温度（25,30,40,50和60℃）和不同的pH值（3.6,4.2,5，5.8，6.5,7.0，7.5,8和9），不同的碳源例如葡萄糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖和淀粉都被用来确

定他们对产酶的作用效果。

酶提取

22mL0.1M的磷酸缓冲液（pH6.5)加入到培养基中，将混合物置于旋转振动器中，每分钟转速140,19℃条件下，摇晃30min。将混合物通过纱布过滤，得到的滤液放入离心机中以每分钟转速8000转4℃条件下离心15min。将上清液通过1号滤纸过滤，滤液便用来作为粗酶制剂。

酶活力试验

酶活力是通过水解作用中，还原糖的释放量来估算的，1%浓度的淀粉在0.1M磷酸缓冲液，pH6.5,25℃条件下通过二硝基水杨酸反应20min。在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物为葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。酶活力由比活度呈现，既每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是u/mg

酶底物反应时间

为了确定反应时间对酶活力的影响，将酶底物混合物用不同的温育周期5,10,20,30,40和50分钟温育培养，之后配活力将被测定。

底物浓度

底物浓度对酶活力的影响是测量混合反应物种，不同的淀粉浓度（0.25,0.5,0.75,1.0,1.25,1.5,1.75%）。

温度和pH

pH对酶活力的影响用在pH范围3.6-9.0温育反应混合物来测定。最是温度对酶活力的影响按着试验指导的在25-70℃温度范围内来测定。

淀粉酶的热稳定性

淀粉酶的人稳定性是由在25-60℃温度范围内温育1小时除去底物的淀粉酶馏分来测定的。采用每10分钟间隔，0.5mL等份式样温育。

统计分析

所有的试验都做了相同的三分，并且重复三次。对收集到的样品进行备份，以便进行淀粉酶的生产与酶活力的测定。

结果与讨论

分离筛选

初选用淀粉水解的方法来进行。在分离真菌单菌落的过程中，曲霉菌JGI12在淀粉琼脂培养基中表现出了更高的分解淀粉的活力，从而被挑选出来作为后续研究。

培养基的比较

混合培养基发酵是由2.5g的以上任意一种培养基和2.5g的小麦麸皮混合而成的，在25℃温度下，以曲霉属真菌JGI12为菌种培养6天用于淀粉酶的生产。米糠培养基和芝麻油滤饼培养基分别显现出了最高和最低的葡萄糖淀粉酶的比活度（16.42和2.03U/mg)。（图一）

最适培养条件

在比较研究中，混合培养基发酵最用了三种培养基组合方式。组合方式一：由RB，COC，和GOC三种培养基按2：1.5:1.5的比率混合。（图二）。组合方式二：由WB，RB，和GOC三种培养基按1:2:2的比率混合。（图三）

温度，pH，和碳源的补充对淀粉酶活力的影响

结合方式二由于表现出了更高的淀粉酶活力因而被选作用于后续研究。最大产酶量发生在30℃（4）和pH5.8(5)。用葡萄糖作为碳源的补充时可使酶的产量达到最大（6）。增加葡萄糖，蔗糖或者淀粉的培养基不没有添加补充物的培养基的产酶量要高，这样就凸显出培养基中添加补充物对提

高酶产量有重要作用。麦芽糖和乳糖对酶的生产表现出少量的抑制作用。（6）

酶与底物反应时间

当用温育培养5分钟酶底物反应混合物时，培养筛选出真菌单菌落表现出最高的酶活力。之后随着时间的增加，酶活力逐渐降低。（7）

培养基的浓度

粗酶的提取可以发生在（0.25-1.75%)之间不同浓度的培养基中，然而实验发现1%淀粉培养基使相对活力达到最大。（8）

温度和pH值

温度和pH是最重要的反应因素，它们能够明显地影响酶活力。使酶活力达到最大的温度是30℃。之后随着温度的增加，酶活力降低。（9）pH对酶活力的影响表现出。酶在pH5.8-9.0之间有两个最大酶活力。一个是发生在偏酸性的pH5.8条件下，另一个是pH9时。（10）这表明，酶将会在要求pH范围较广的条件下的生产过程中，展现出巨大的用处。多重pH最适条件表明在酶制剂中存在至少两种使淀粉水解的酶活力。这两种酶分别是α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

热稳定性