生物技术实验内容
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5. 分化：放入95％乙醇中分色2-3秒钟。 6. 镜检
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实验报告
1. 简述Branchet反应的原理和实验的关键步 骤。
2. 绘图显示蟾蜍红细胞中DNA和RNA的分布。
3. 细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色， 而其中核仁被染成紫红色。这种颜色的差异 说明什么？
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实验四
酶细胞化学
实验目的
几个强调的注意事项：
1. 组长负责制：实验前后务必检查清点实 验器材、标本(永久制片)的数量及质量。 老师检查后组长才可离开。 2. 严格执行操作程序，爱护公物。 3. 不要往水池内丢弃杂物。 4. 值日。
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实验内容
实验一、特殊显微镜的使用 实验二、细胞的形态结构与显微测量 实验三、Brachet反应－显示DNA和RNA 实验四、酶细胞化学 实验五、细胞生理活动的实验观察 实验六、细胞核与线粒体的分级分离 实验七、细胞分裂的形态观察 实验八、细胞原代培养 实验九、细胞计数及死活细胞的鉴定 实验十、细胞显微摄影
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实验用品
1. 材料和标本：蟾蜍。
2. 器材和仪器: 光学显微镜、剪刀、镊子、 注射器、载玻片、吸水纸。 3. 试剂：甲基绿－派洛宁醋酸缓冲液、70 ％乙醇、95％乙醇、蒸馏水。
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1.Principle for staining
• Methly-green can combine the DNA tightly,so let the DNA become green. • Pyronin can combine the RNA tightly, so we can see the RNA is red. • So use this dye we can distinguish the DNA and RNA easily.
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2.Procedure:
Get a slide *Make a blood smear
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1. Place a small drop of toad blood near one end of the slide, get another slide as a spreader, put it before the drop, then draw it back to contact with the drop, allowing the drop to bank evenly behind the spreader. 2. The angle between two slides has to be 30-40 。 . 3. Push to the left end in a smooth, quick motion. 4. Allow the smear to
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实验一 特殊显微镜的使用
实验目的
• 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方 法。
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实验原理
• 某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物 质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质， 经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分 虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物 质结合，经紫外线照射后可诱发荧光。荧光显 微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置， 可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。
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实验用途
• 1、观察活细胞内物质的吸收与运输，化 学物质的分布与定位等。 • 2、利用免疫荧光显微技术，对细胞内的 特异成分进行精确定位研究。 • 3、与分光光度计结合构成的显微分光光 度计，可对细胞内物质进行定量分析
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使用方法
1、开启电源 打开电源开关，当电压表的指针稳定在220v时再进行下一步操作。 启动高压汞灯。 待10min左右汞灯稳定状态后，再进行操作。 2、调中光轴 将灯前镜摆出光路。 用滤光组的2、3、4中任一组。 放一张标本片在载物台上，选25倍物镜，调焦到成像。 关小视场光圈，调凸镜调节杆到光圈在标本平面上面成像。 调节聚光器调中钮至光圈图像居中，然后回复光圈到与视野等大。 #
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（二）方法与步骤
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Result ：
Toad blood cell stained with Methyl green - Pyronine
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report
• Procedure of the manipulation. • Make drawing of the toad blood smear to show the position of the DNA and RNA.
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（三）结果 涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或 棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。 过氧化物酶阳性细胞的细胞质中有 棕黄色物质，因含酶的多少不同，颜色 深浅不一；深者为过氧化物酶阳性细胞， 浅者为过氧化物酶弱阳性细胞，而无色 者 为 过 氧 化 物 酶 阴 性 细 胞 。
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二 、细胞中多糖的测定
（一）实验原理 高碘酸－希夫试剂反应，简称PAS反应。 主要是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强 氧化剂能打开C-C键，使多糖分子中的乙二 醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与希夫 试剂反应形成紫红色化合物。颜色的深浅 与糖类的多少有关。
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Structure of the microscope
Mechanical part Optics part Lighting part
#
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(一)临时制片——口腔上皮细 胞标本的制备
• 取载玻片一张(揩净)→加一滴生理盐水→ 取材(口腔内颊部上皮细胞)→涂于生理盐 水中→盖盖玻片→染色(甲基蓝)1’→观
Air dry
Fix in 70% alcohol Air dry staining 5~10min
5~10min
observe #
Observe by the microscope
Cytoplasm(RNA,red) Nuclear(DNA,green)
Unna staining
methyl green DNA pyronine RNA
3、调中光源 将灯前镜摆入光路。 拨动灯前镜调焦杆，使灯影光斑清晰。 先调节灯泡调中钮，到灯影光斑居中，再 调节反射镜调中钮，到反射影光斑居中。 最后将灯前镜摆出光路，即可正常使用。
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物镜：10×、40×、250× 最大放大倍数：2500× 荧光、相差、双目
德国LeicaDMLFra Baidu bibliotek荧光显微镜
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实验二
• 载玻片 • 牙签 • 吸水纸 • 永久制片 盖玻片 擦镜纸 纱布 镜台测微尺
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实验内容
临时制片——口腔上皮细胞标本的制备
显微测量
永久制片的观察
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using of the microscope
(I) Use of low objective lens
(II) Use of high objective lens
格的长度为0.01mm(10μm)。
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(3)标定方法
• ①将镜台测微尺置镜台上。
• ②低倍下找到镜台测微尺，使之与目镜 测微尺平行且左端对齐(0刻度重合)。
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• ③由左向右找到目镜测微尺与镜台测微 尺重合的位点，分别记录两尺重合处的 刻度，计算目镜测微尺每小格的长度。
如镜台测微尺1mm处(全长)与目镜测微尺75 刻度(150小格)重合，则:
Making the smear:
1.
2.
3.
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蟾蜍血涂片的制作
解剖蟾蜍 心脏取血 滴一滴于载玻片一端 取另一载玻片使其 一侧接触血液,让血液展开 45°推片(薄而均匀) 自然晾干
#
#
2. Procedure:
Get a slide *Make a blood smear
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椭圆V=4πab2/3(a 长半径,b短半径)
圆V=4/3R3(R半径) Vn
V=
Vn细胞核体积
Vc细胞体积
Vc- Vn
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(三)永久制片的观察
#
Observation of cell morphological structure
human blood smear toad blood smear mouse small intestine pillar epidermal cell skeleton muscle slide
察
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(二)显微测量
• 1．显微测量计
目镜测微尺 镜台测微尺
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(1) 目镜测微尺
• 1.外形是一圆形玻片，装入目镜镜筒中。
• 用于测量标本用。
• 2.刻度标记0~100，实际分为200等份，
每一个格的长度需用镜台测微尺标定。
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(2) 镜台测微尺
• 1.外形是一载玻片，上有一带精细刻度的
标尺。
• 2.总长度为1mm，分为100等份，每一个
细胞的形态结构与显 微测量
实验目的
• (一) 观察并了解细胞的基本形态。 • (二)掌握临时制片和显微绘图的方法。 • (三)了解显微测微尺的原理及使用方法
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实验用品
(一)材料：
• 人口腔上皮细胞(自取) • 蛙血细胞涂片 • 人血涂片 • 单层柱状上皮细胞永久制片 • 骨骼肌纵切片
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(二)器材：
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四、作业
• 1．绘制口腔上皮细胞(点线绘图法)
• 2．低倍镜、高倍镜下测微尺的标定方法
及结果
• 3．计算核质比
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镜台测微尺
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目镜测微尺（200小格）
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实验三
Brachet反应－显示 DNA和RNA
实验目的
1、了解核酸的细胞化学反应原理 2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布 3、掌握Brachet反应及血涂片的制作方法
1 目镜测微尺每小格的实际长度= 150 mm
=0.0067mm=6.7μ m
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④同样的方法标定高倍镜下目镜测微尺 每小格的实际长度 计算公式如下: 目镜测微尺每小格的实际长度 30×10μm 镜台测微尺长度 ＝ ＝ 200 目镜测微尺格数
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(4)测量细胞并计算核质比
• ①口腔上皮细胞标本片→低倍镜下选无重叠、 伸展良好、结构完整的细胞→换高倍镜测量。 • ②口腔上皮细胞为扁平形(近似椭圆形), 测细 胞的长半径(直径)，短半径(直径)，计算细胞 体积。以同样方法测核并计算核体积(或将核 近似看作球形)。 • ③按公式计算核质比。
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实验内容
原理
细胞经甲基绿－派络宁混合液处理后，其 中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般 认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料 派络宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料 的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA 呈蓝绿色，派络宁染低聚分子的RNA呈红色。
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1. 制备蟾蜍血涂片：打开蟾蜍胸腔，暴露心脏，注射 器取血1ml。滴一滴血于干净载玻片的一端，右手 取另一张载玻片，使其一端紧贴血滴，以30°－ 40°角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片。 2. 固定：将晾干的血涂片浸入70％的乙醇中，固定510分钟，取出后室温下晾干。 3. 染色：将血涂片放于染色盘架上，加数滴甲基绿－ 派洛宁染液于血涂片上，将染液铺平，染色15-20分 钟。 4. 冲洗：先用细流水冲洗，放入蒸馏水中轻轻漂洗2-3 次（2-3秒钟左右），将玻片立于吸水纸上，吸去多 余的水分。
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10x10
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•.
#
#
#
erythrocytes
leucocyte Blood platelet
#
Chalice-shaped
(columnar,dense, elliptical-shaped nuclear) Pillar cell
10x40 #
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Skeleton muscle cell(fibrous,have many myofibril) nuclei
1、学会临时制片法 2、熟悉酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化 物酶显示方法的原理及操作步骤 3、观察酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化 物酶在细胞中的分布
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一 、过氧化物酶显示
（一）实验原理 过氧化酶主要存在于血液、骨髓细 胞的粒细胞系。其反应原理为：过氧化 物酶能把许多胺类氧化为有色化合物。 用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物 酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝， 进而变为棕色产物，因而可以根据颜色 反应来判定过氧化物酶的有无或多少。
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（二）方法与步骤
1. 取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开 其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用 PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴 到载玻片上。 2. 推片，室温晾干。 3. 将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒－1分钟。 4. 取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。 5. 清水冲洗，放入1％番红溶液 中复染2分钟。 6. 清水冲洗，室温晾干。 7. 镜检。
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实验报告
1. 简述Branchet反应的原理和实验的关键步 骤。
2. 绘图显示蟾蜍红细胞中DNA和RNA的分布。
3. 细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色， 而其中核仁被染成紫红色。这种颜色的差异 说明什么？
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实验四
酶细胞化学
实验目的
几个强调的注意事项：
1. 组长负责制：实验前后务必检查清点实 验器材、标本(永久制片)的数量及质量。 老师检查后组长才可离开。 2. 严格执行操作程序，爱护公物。 3. 不要往水池内丢弃杂物。 4. 值日。
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实验内容
实验一、特殊显微镜的使用 实验二、细胞的形态结构与显微测量 实验三、Brachet反应－显示DNA和RNA 实验四、酶细胞化学 实验五、细胞生理活动的实验观察 实验六、细胞核与线粒体的分级分离 实验七、细胞分裂的形态观察 实验八、细胞原代培养 实验九、细胞计数及死活细胞的鉴定 实验十、细胞显微摄影
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实验用品
1. 材料和标本：蟾蜍。
2. 器材和仪器: 光学显微镜、剪刀、镊子、 注射器、载玻片、吸水纸。 3. 试剂：甲基绿－派洛宁醋酸缓冲液、70 ％乙醇、95％乙醇、蒸馏水。
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1.Principle for staining
• Methly-green can combine the DNA tightly,so let the DNA become green. • Pyronin can combine the RNA tightly, so we can see the RNA is red. • So use this dye we can distinguish the DNA and RNA easily.
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2.Procedure:
Get a slide *Make a blood smear
#
1. Place a small drop of toad blood near one end of the slide, get another slide as a spreader, put it before the drop, then draw it back to contact with the drop, allowing the drop to bank evenly behind the spreader. 2. The angle between two slides has to be 30-40 。 . 3. Push to the left end in a smooth, quick motion. 4. Allow the smear to
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实验一 特殊显微镜的使用
实验目的
• 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方 法。
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实验原理
• 某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物 质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质， 经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分 虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物 质结合，经紫外线照射后可诱发荧光。荧光显 微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置， 可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。
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实验用途
• 1、观察活细胞内物质的吸收与运输，化 学物质的分布与定位等。 • 2、利用免疫荧光显微技术，对细胞内的 特异成分进行精确定位研究。 • 3、与分光光度计结合构成的显微分光光 度计，可对细胞内物质进行定量分析
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使用方法
1、开启电源 打开电源开关，当电压表的指针稳定在220v时再进行下一步操作。 启动高压汞灯。 待10min左右汞灯稳定状态后，再进行操作。 2、调中光轴 将灯前镜摆出光路。 用滤光组的2、3、4中任一组。 放一张标本片在载物台上，选25倍物镜，调焦到成像。 关小视场光圈，调凸镜调节杆到光圈在标本平面上面成像。 调节聚光器调中钮至光圈图像居中，然后回复光圈到与视野等大。 #
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（二）方法与步骤
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Result ：
Toad blood cell stained with Methyl green - Pyronine
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report
• Procedure of the manipulation. • Make drawing of the toad blood smear to show the position of the DNA and RNA.
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（三）结果 涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或 棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。 过氧化物酶阳性细胞的细胞质中有 棕黄色物质，因含酶的多少不同，颜色 深浅不一；深者为过氧化物酶阳性细胞， 浅者为过氧化物酶弱阳性细胞，而无色 者 为 过 氧 化 物 酶 阴 性 细 胞 。
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二 、细胞中多糖的测定
（一）实验原理 高碘酸－希夫试剂反应，简称PAS反应。 主要是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强 氧化剂能打开C-C键，使多糖分子中的乙二 醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与希夫 试剂反应形成紫红色化合物。颜色的深浅 与糖类的多少有关。
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Structure of the microscope
Mechanical part Optics part Lighting part
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(一)临时制片——口腔上皮细 胞标本的制备
• 取载玻片一张(揩净)→加一滴生理盐水→ 取材(口腔内颊部上皮细胞)→涂于生理盐 水中→盖盖玻片→染色(甲基蓝)1’→观
Air dry
Fix in 70% alcohol Air dry staining 5~10min
5~10min
observe #
Observe by the microscope
Cytoplasm(RNA,red) Nuclear(DNA,green)
Unna staining
methyl green DNA pyronine RNA
3、调中光源 将灯前镜摆入光路。 拨动灯前镜调焦杆，使灯影光斑清晰。 先调节灯泡调中钮，到灯影光斑居中，再 调节反射镜调中钮，到反射影光斑居中。 最后将灯前镜摆出光路，即可正常使用。
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物镜：10×、40×、250× 最大放大倍数：2500× 荧光、相差、双目
德国LeicaDMLFra Baidu bibliotek荧光显微镜
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实验二
• 载玻片 • 牙签 • 吸水纸 • 永久制片 盖玻片 擦镜纸 纱布 镜台测微尺
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实验内容
临时制片——口腔上皮细胞标本的制备
显微测量
永久制片的观察
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using of the microscope
(I) Use of low objective lens
(II) Use of high objective lens
格的长度为0.01mm(10μm)。
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(3)标定方法
• ①将镜台测微尺置镜台上。
• ②低倍下找到镜台测微尺，使之与目镜 测微尺平行且左端对齐(0刻度重合)。
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• ③由左向右找到目镜测微尺与镜台测微 尺重合的位点，分别记录两尺重合处的 刻度，计算目镜测微尺每小格的长度。
如镜台测微尺1mm处(全长)与目镜测微尺75 刻度(150小格)重合，则:
Making the smear:
1.
2.
3.
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蟾蜍血涂片的制作
解剖蟾蜍 心脏取血 滴一滴于载玻片一端 取另一载玻片使其 一侧接触血液,让血液展开 45°推片(薄而均匀) 自然晾干
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2. Procedure:
Get a slide *Make a blood smear
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椭圆V=4πab2/3(a 长半径,b短半径)
圆V=4/3R3(R半径) Vn
V=
Vn细胞核体积
Vc细胞体积
Vc- Vn
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(三)永久制片的观察
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Observation of cell morphological structure
human blood smear toad blood smear mouse small intestine pillar epidermal cell skeleton muscle slide
察
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(二)显微测量
• 1．显微测量计
目镜测微尺 镜台测微尺
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(1) 目镜测微尺
• 1.外形是一圆形玻片，装入目镜镜筒中。
• 用于测量标本用。
• 2.刻度标记0~100，实际分为200等份，
每一个格的长度需用镜台测微尺标定。
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(2) 镜台测微尺
• 1.外形是一载玻片，上有一带精细刻度的
标尺。
• 2.总长度为1mm，分为100等份，每一个
细胞的形态结构与显 微测量
实验目的
• (一) 观察并了解细胞的基本形态。 • (二)掌握临时制片和显微绘图的方法。 • (三)了解显微测微尺的原理及使用方法
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实验用品
(一)材料：
• 人口腔上皮细胞(自取) • 蛙血细胞涂片 • 人血涂片 • 单层柱状上皮细胞永久制片 • 骨骼肌纵切片
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(二)器材：
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四、作业
• 1．绘制口腔上皮细胞(点线绘图法)
• 2．低倍镜、高倍镜下测微尺的标定方法
及结果
• 3．计算核质比
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镜台测微尺
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目镜测微尺（200小格）
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实验三
Brachet反应－显示 DNA和RNA
实验目的
1、了解核酸的细胞化学反应原理 2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布 3、掌握Brachet反应及血涂片的制作方法
1 目镜测微尺每小格的实际长度= 150 mm
=0.0067mm=6.7μ m
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④同样的方法标定高倍镜下目镜测微尺 每小格的实际长度 计算公式如下: 目镜测微尺每小格的实际长度 30×10μm 镜台测微尺长度 ＝ ＝ 200 目镜测微尺格数
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(4)测量细胞并计算核质比
• ①口腔上皮细胞标本片→低倍镜下选无重叠、 伸展良好、结构完整的细胞→换高倍镜测量。 • ②口腔上皮细胞为扁平形(近似椭圆形), 测细 胞的长半径(直径)，短半径(直径)，计算细胞 体积。以同样方法测核并计算核体积(或将核 近似看作球形)。 • ③按公式计算核质比。
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实验内容
原理
细胞经甲基绿－派络宁混合液处理后，其 中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般 认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料 派络宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料 的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA 呈蓝绿色，派络宁染低聚分子的RNA呈红色。
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1. 制备蟾蜍血涂片：打开蟾蜍胸腔，暴露心脏，注射 器取血1ml。滴一滴血于干净载玻片的一端，右手 取另一张载玻片，使其一端紧贴血滴，以30°－ 40°角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片。 2. 固定：将晾干的血涂片浸入70％的乙醇中，固定510分钟，取出后室温下晾干。 3. 染色：将血涂片放于染色盘架上，加数滴甲基绿－ 派洛宁染液于血涂片上，将染液铺平，染色15-20分 钟。 4. 冲洗：先用细流水冲洗，放入蒸馏水中轻轻漂洗2-3 次（2-3秒钟左右），将玻片立于吸水纸上，吸去多 余的水分。
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10x10
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•.
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erythrocytes
leucocyte Blood platelet
#
Chalice-shaped
(columnar,dense, elliptical-shaped nuclear) Pillar cell
10x40 #
#
Skeleton muscle cell(fibrous,have many myofibril) nuclei
1、学会临时制片法 2、熟悉酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化 物酶显示方法的原理及操作步骤 3、观察酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化 物酶在细胞中的分布
#
一 、过氧化物酶显示
（一）实验原理 过氧化酶主要存在于血液、骨髓细 胞的粒细胞系。其反应原理为：过氧化 物酶能把许多胺类氧化为有色化合物。 用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物 酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝， 进而变为棕色产物，因而可以根据颜色 反应来判定过氧化物酶的有无或多少。
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（二）方法与步骤
1. 取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开 其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用 PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴 到载玻片上。 2. 推片，室温晾干。 3. 将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒－1分钟。 4. 取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。 5. 清水冲洗，放入1％番红溶液 中复染2分钟。 6. 清水冲洗，室温晾干。 7. 镜检。