南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解
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2014酶工程第三章动植物发酵产酶课件
第二节 植物细胞培养产酶
植物细胞培养产酶 – 1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并 培养成植株的设想 – 植物细胞的全能性
Haberlandt
植 物 细 胞 培 养 产 酶
– 植物细胞培养产酶种类
产酶植物细胞 胡萝卜细胞 紫苜蓿细胞 糖苷酶 产酶品种
-半乳糖苷酶
过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶
植 物 细 胞 培 养 产 酶
2.获取植物细胞：愈伤组织诱导法（分散细胞） （利用细胞的全能性）
• 愈伤组织（callus） – 由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散 排列的薄壁细胞群体；本意是指植物体的局部受到 创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的 组织 • 诱导过程 – 配制半固体诱导培养基 – 灭菌、植入外植体 – 1～3周后继代培养
2.基因扩增加速酶的合成
• 通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发
育某一阶段或细胞分化某一过程
• 细胞的一种应急方式
• 基因扩增可以由选择压力引起
– 耐药性细胞的抗药性产生
– 例：CHO 细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶
的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增
3.增强子促进酶的生物合成
• 增强子（modulator）—— 能高效增强或促进基因转录 的一段DNA 序列 • 增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效
过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶 苯丙氨酸裂合酶 漆酶
甜菜细胞
大豆细胞 花生细胞 假挪威槭细胞 利马豆细胞 番木瓜细胞
-葡萄糖苷酶
木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶
大蒜细胞
菠萝细胞 剑麻细胞
超氧化物歧化酶
菠萝蛋白酶 剑麻蛋白酶
植 物 细 胞 培 养 产 酶
《酶工程》课件-动植物细胞培养产酶
（6）动物细胞、植物细胞和微生物细胞用于生产的主要产物 各不相同。
3
动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
1、提高产率。 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可
以明显提高天然产物的产率。
一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数 年或更长时间。而植物细胞生长的倍增时间一般为12— 60h，一般生产周期l 5-30天，植物细胞培养可大大地缩短 生产周期。
5
动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
7、原代细胞继代培养50代后，就会退化死亡，需要重
新分离细胞。
8
一、植物细胞培养产酶 2、植物细胞的特性
（一）植物细胞的特性
植物细胞与微生物细胞和动物细胞相比主要有以下特性：
（1）植物细胞比微生物细胞大得多；植物细胞也比动物细 胞大。
（2）植物细胞的生长和代谢速率比微生物细胞低，生长倍增 时间和生产周期也比微生物长 。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。
3、易于管理，减轻劳动强度。
植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产， 不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减 轻劳动强度，改善劳动条件。
4、提高产品质量。
植物细胞培养的产物杂质较少，在严格控制条件的生物
反应器中生产，可以减小环境中有害物质的污染和微生物、
昆虫的侵蚀，产物易于分离纯化。
例如：日本三井石油化学工业公司于1983年在世
界上首次成功地用紫草细胞培养生产紫草宁。他们用
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
1、提高产率。 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可
以明显提高天然产物的产率。
一般植物从发芽、生长到收获，短则几个月，长则数 年或更长时间。而植物细胞生长的倍增时间一般为12— 60h，一般生产周期l 5-30天，植物细胞培养可大大地缩短 生产周期。
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动、植物细胞培养产酶
一、植物细胞培养产酶 （二）植物细胞培养的特点
植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离 这些物质相比，具有如下列特点：
7、原代细胞继代培养50代后，就会退化死亡，需要重
新分离细胞。
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一、植物细胞培养产酶 2、植物细胞的特性
（一）植物细胞的特性
植物细胞与微生物细胞和动物细胞相比主要有以下特性：
（1）植物细胞比微生物细胞大得多；植物细胞也比动物细 胞大。
（2）植物细胞的生长和代谢速率比微生物细胞低，生长倍增 时间和生产周期也比微生物长 。
（3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。
3、易于管理，减轻劳动强度。
植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产， 不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减 轻劳动强度，改善劳动条件。
4、提高产品质量。
植物细胞培养的产物杂质较少，在严格控制条件的生物
反应器中生产，可以减小环境中有害物质的污染和微生物、
昆虫的侵蚀，产物易于分离纯化。
例如：日本三井石油化学工业公司于1983年在世
界上首次成功地用紫草细胞培养生产紫草宁。他们用
酶工程 第三章酶的发酵生产 第三节发酵工艺条件及控制
为了获得足够多的能量，以满足细胞生长和发酵产酶 的需要，培养基中的能源（一般是碳源提供）必须经有氧 解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
第三节 发酵工艺条件及控制
无机元素是通过添加无机盐来提供的，一般采用水溶 性的硫酸盐、磷酸盐或盐酸盐等。有时也使用硝酸盐，在 提供无机氮的同时，提供无机元素。
4．生长因素 生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化 合物主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动 植物生长激素等。各种氨基酸是蛋白质和酶的组分；嘌呤 和嘧啶是核酸和某些辅酶的组分；维生素主要起辅酶作用； 动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分 裂起调节作用。有的细胞能够自己合成各种生长因素，而 有的细胞则缺少合成一种或多种生长因素的能力，需由外 界供给，才能正常生长繁殖，这样的细胞称为营养缺陷型。
第三节 发酵工艺条件及控制
在酶的发酵生产中，通常在培养基中加进玉米浆、酵 母膏等，以提供各种必需的生长因素。有时，也加进纯化 的生长因素，以供细胞生长繁殖之需。
现举例几种酶发酵培养基： （1）枯草杆菌BF7658α—淀粉酶发酵培养基：玉米粉 8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氧化钙 0.2%，氯化铵0.15%。 （2）枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米 粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%，米糠1%，磷酸氢二钠0.4%， 磷酸二氢钾0.03%。 （3）黑曲霉糖化发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%， 麸皮1%（PH4.4—5.0）。
第三节 发酵工艺条件及控制
不同细胞生长繁殖的最适PH有所不同。一般细胞和放 线菌的生长最适PH为中性或微碱性（PH6.5—8.0）；霉菌 和酵母的生长最适PH为偏酸性（PH4.0—6.0）；植物细胞 生长的最适PH为5—6。
酶工程第3版
一、动植物细胞的特点: 动植物细胞的特点
• 1、体积比微生物大； 、体积比微生物大； • 2、对剪切力敏感； 、对剪切力敏感； • 3、生长和代谢速率低，生长倍增时间和发酵 、生长和代谢速率低， 周期长； 周期长； • 4、动物细胞营养要求复杂； 、动物细胞营养要求复杂； • 5、发酵产物不同 、
三、动物细胞发酵
1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物，特 、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物， 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 别是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶， 由动物细胞培养生产的酶有胶原酶，血纤蛋白溶 酶原活性剂等。 酶原活性剂等。 2、动物细胞培养方法： 、动物细胞培养方法： 悬浮培养； 悬浮培养；固定化细胞培养 3、动物细胞发酵工艺植物细胞发酵技术和特点： 、植物细胞发酵技术和特点： 植物细胞发酵技术 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： 发酵特点（与直接提取分离相比较而言）： （1）提高产率； ）提高产率； （2）缩短周期 ）缩短周期; （3）易于管理、减轻劳动强度； ）易于管理、减轻劳动强度； （4）提高质量。 ）提高质量。
2、植物细胞发酵技术 、 (I)高产细胞系的选择： 主要有以下几个途径： 高产细胞系的选择： 高产细胞系的选择 主要有以下几个途径： 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择,细 材料选择，克隆选择，抗性选择，诱变选择 细 胞工程和基因工程选择； 胞工程和基因工程选择； (II)影响产物产量的因素： 材料来源 培养基成分， 影响产物产量的因素： 材料来源,培养基成分 培养基成分， 影响产物产量的因素 光照和温度， ，细胞形态分化程度等; 光照和温度，pH，细胞形态分化程度等 (III)提高产物产量的途径： 选择高产细胞系，控 提高产物产量的途径： 提高产物产量的途径 选择高产细胞系， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 制细胞生长和分化程度，加入诱导物或前体， 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 两相培养和产物释放，毛壮根培养技术。 (IV)植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器。 植物细胞培养系统专用的生物反应器
动植物细胞培养产酶 (3)优秀课件
动植物细胞培养产酶 (3)优 秀课件
第三章 动植物细胞培养产酶
主要内容 植物细胞培养产酶 动物细胞培养产酶
要求 了解动、植物细胞及其培养的特点； 熟悉动、植物细胞培养的工艺条件及其控
制。
一、概述
1.什么是动、植物细胞Байду номын сангаас养？
动植物细胞在体外条件下的存活或生长。
2.如何获得动、植物细胞？
（3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；
（4适）宜植温物度细在胞20一℃般-2以5℃蔗，糖酶为合碳成源温、度浓因度植为物2-种5%类。而异；
通气和搅拌 植物细胞培养要求稳定的pH，一般控制在pH5.8-6.1最好。
耗氧速率较慢，细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏感，所以，通气
其他和搅拌不能太强烈。
光照：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。 刺激物：在酶合成时期，适当添加。
外45植） ）体提其高他的产选品择质和量处理→愈伤组织的诱导→ 细胞对的剪获切取力敏→感细、胞生培产周养期→长分、离生纯长和化→产物
代谢需要一定的光照。 外植体的选择与处理：
选择外植体、切取片机段械、捣消碎毒发处：理动。作轻柔
直接分离法
植物愈伤组织
过滤、离心分离
愈伤组织诱导法
酶分解法：纤维素酶、果胶酶等
原生质体能再迅生速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团
外植体
插入 半固体培养基
培养
去除细胞壁后得到的微球体 灭菌、冷却
25℃
生长素、分裂素
1-3周
愈伤组织
分散、接种
3、植物细胞培养产酶的工艺特点
培养基
（1）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐；
培养温度和pH （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；
第三章 动植物细胞培养产酶
主要内容 植物细胞培养产酶 动物细胞培养产酶
要求 了解动、植物细胞及其培养的特点； 熟悉动、植物细胞培养的工艺条件及其控
制。
一、概述
1.什么是动、植物细胞Байду номын сангаас养？
动植物细胞在体外条件下的存活或生长。
2.如何获得动、植物细胞？
（3）植物细胞需求的氮源一般为无机氮源；
（4适）宜植温物度细在胞20一℃般-2以5℃蔗，糖酶为合碳成源温、度浓因度植为物2-种5%类。而异；
通气和搅拌 植物细胞培养要求稳定的pH，一般控制在pH5.8-6.1最好。
耗氧速率较慢，细胞比较大，较脆弱，对剪切力敏感，所以，通气
其他和搅拌不能太强烈。
光照：对一些植物酶有诱导作用或抑制作用。 刺激物：在酶合成时期，适当添加。
外45植） ）体提其高他的产选品择质和量处理→愈伤组织的诱导→ 细胞对的剪获切取力敏→感细、胞生培产周养期→长分、离生纯长和化→产物
代谢需要一定的光照。 外植体的选择与处理：
选择外植体、切取片机段械、捣消碎毒发处：理动。作轻柔
直接分离法
植物愈伤组织
过滤、离心分离
愈伤组织诱导法
酶分解法：纤维素酶、果胶酶等
原生质体能再迅生速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团
外植体
插入 半固体培养基
培养
去除细胞壁后得到的微球体 灭菌、冷却
25℃
生长素、分裂素
1-3周
愈伤组织
分散、接种
3、植物细胞培养产酶的工艺特点
培养基
（1）植物细胞的生长和代谢需要大量无机盐；
培养温度和pH （2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素；
酶的发酵工程PPT课件
在核糖体上合成多肽（三阶段）
1、起始阶段 2、延伸阶段 3、终止阶段
肽链合成的起始阶段
1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物
2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：
30S-mRNA-IF3
fMet-tRNA-IF2-GTP
IF1
30S起始复合物
fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。
延长部位
（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)
定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖 体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合 成多肽链的过程。
酪
5’
酪氨酰- tRNA
5’
AUG GUU UAC ACA
反密码
3’ mRNA
密码与反密码的碱基配对
给位 (P位) 大亚基
第二章
酶的生物合成与发酵生产
提取分离法 微生物细胞发酵产酶
酶的生产方法
生物合成法
化学合成法
植物细胞发酵产酶
动物细胞发酵产酶
第一节
酶生物合成及调节
一、酶的生物合成
遗传信息传递的中心法则
转 录 复制 传 DNA 递 转录 给 R N 逆转录 A 蛋白质 RNA ， 翻译 再 复制 由 R N
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)
µ max：最大比生长速率（1/h） S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L 或 mol/L
Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，
蛋 苏
Mg+ K+
移位
GTP
UAC UGU AUG ACA GUU 3’ 5’
转肽
酶工程重点(南林大)
合。
酶工程重点1.酶催化作用的特点（1）只能进行热力学上允许进行的反应；（2）可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡；（3）通过降低活化能加快化学反应速度。
* 活化能：在一定浓度下，1mol 底物全部进入活化态所需要的自由能（kg/mol ）2.米氏方程的推导酶促反应：（1）酶与底物作用，形成酶-底物复合物：E + S 11k k - [E（2）酶-底物复合物分解形成产物，释放出游离酶：[ES]2k −−→E + P 推导：（1）根据“中间产物学说”得:[ES]2k v =（2）根据“拟稳态学说”得：0][][][])[]([,0][21-1=--⋅-=ES k ES k S ES E k dtES d 即 变式得：121-][][][][k k k ES S ES E +=⋅-）（ 令：121-k k k K m += 则：][]][[][][][][][S K S E ES K ES S ES E m m +=⇒=⋅-）（ 故][]][[][22S K S E k ES k v m +== 由于反应系统中：[S]>>[E]，当[S]很高时所有酶都被底物所饱和形成ES ，即[E]=[ES],酶促反应达到最大速率：][][22max E k ES k V ==最终得：][][max S K S V v m += ——米氏方程 3.米氏常数的测定和意义（1）测定：（基本原则）将米氏方程变化成相当于y=ax+b 的直线方程，再用作图法求Km. 双倒数作图法：maxmax 1][11V S V K v m +⋅= （2）意义：①当v=Vmax/2时，Km=[S]（Km 单位mol/L ）②是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km 的值，可鉴别酶。
③可近似表示酶和底物亲和力：Km 愈小，E 对S 的亲和力愈大；Km 愈大，E 对S 的亲和力愈小。
4.可逆抑制的种类和判别（1）竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结 Vmax 不变，Km 变大，酶促反应速度减小（2）非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。
《酶工程》课件-微生物发酵产酶
05
微生物发酵产酶存在问题与挑战
产量问题
微生物发酵产酶产量低
由于微生物发酵过程中受到多种因素 的影响，如营养物质的供应、发酵条 件、微生物菌种等，导致酶的产量较 低。
发酵周期长
微生物发酵产酶通常需要较长的发酵 周期，这增加了生产成本和时间成本。
稳定性问题
酶稳定性差
许多酶在发酵过程中容易受到温度、pH值、金属离子等因素的影响，导致酶的稳定性降低。
04
微生物发酵产酶应用实例
工业应用
洗涤剂制造
微生物发酵产生的酶可用于制造 洗涤剂，如蛋白酶用于去除蛋白 质污渍，淀粉酶用于去除淀粉污
渍。
纺织工业
利用微生物发酵产生的酶处理纺织 品，可以改善其质地、手感和外观， 如纤维素酶用于棉织物的生物抛光。
造纸工业
通过微生物发酵产酶技术，可以改 进造纸工艺，提高纸张质量和降低 环境污染，如木聚糖酶用于纸浆漂 白。
过程优化与控制
通过人工智能技术，对微生物发酵产酶过程进行建模和优化，提高 目标酶的产量和质量。
个性化定制酶
结合人工智能和基因工程技术，实现个性化定制酶的合成，满足不 同领域的需求。
THANKS
感谢观看
《酶工程》课件-微生物发酵 产酶
• 微生物发酵产酶概述 • 微生物发酵产酶原理与过程 • 微生物发酵产酶技术与方法
• 微生物发酵产酶应用实例 • 微生物发酵产酶存在问题与挑战 • 未来发展趋势与展望
01
微生物发酵产酶概述
酶工程简介
酶工程定义
酶工程是生物工程的重要组成部分，是利用酶或者微生物细胞、动植物细胞、 细胞器等具有的生物催化功能，借助工程手段来生产有用物质、设计改造酶或 者生产细胞、器官乃至整个生物体的一门科学技术。
酶工程：动植物细胞培养产酶
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例
SOD是生物体内清除超氧化物阴 离子自由基(O 2—)的重要金属酶 类。它和过氧化氢酶、过氧化物 酶一起构成了生物体内重要的酶 促反应防御体系，从而维护生物 体内细胞正常的生理代谢和生化 反应。衰老自由基学说认为衰老 源于机体正常代谢过程中产生过 量的自由基对机体损害的结果。 超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化 超氧阴离子发生歧化反应的自由 基清除剂，具有延缓衰老的作用。
(2)大蒜悬浮细胞培养
将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈 伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D 和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃， 600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使 愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞 团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux， 12h/d光照条件下震荡培养18d。
二、动物细胞培养的特点
（1）主要用于生产各种功能蛋白质； （2）生长缓慢； （3）需加抗生素防污染； （4）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感； （5）具锚地依赖性，宜贴壁培养；部分用悬浮培养； （6）培养基成分复杂，反应过程成本高，产品价格贵 ；
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如：紫草宁的生产， 发酵细胞中的紫草宁比 紫草根中高10倍。
紫草宁的结构
（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影 响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中 各种有害物质污染和侵蚀。 （5）其它 设计植物细胞生物反应器和控制工艺条件时应 注意一些问题。
酶工程第三章 动植物细胞培养产酶
制备微载体的材料主要有：
葡聚糖（DEAE—Sephadex A50及A25 ） 塑料 明胶 玻璃 纤维素
四、动物细胞培养的工艺条件及其控制
种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞； 工艺过程：
胰蛋白酶
种质 细胞
悬浮 细胞
悬浮培 养或贴 壁培养
收集培 养液、 分离纯 化
（一）动物细胞培养基组成成分
生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程
１、人黑色素瘤细胞培养基；
２、人黑色素瘤细胞培养；
３、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作为碳源和能源利用； 2、维生素：血清中，B族和维C； 3、无机盐：调节渗透压； 4、葡萄糖：作为碳源和能源； 5、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松； 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。
（二）动物细胞培养基的配制
首先配制各类母液，使用前混合过滤除菌， 使用时稀释至所需浓度； 各种动物培养基已商品化。
（六）溶解氧的控制
溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要； 采用调节混合气体的量与比例的方法。
南京林业大学酶工程-酶的应用
橙皮苷酶
氨基酰化酶 天冬氨酸酶 磷酸二酯酶 色氨酸合成酶 核苷磷酸化酶
黑曲霉
霉菌、细菌 桔青霉、曲霉 细菌 酵母
防止柑桔罐头及桔汁出现混浊
由DL-aa生产L-aa 降解RNA、生产单核苷酸 生产色氨酸 生产ATP
大肠杆菌、假单胞杆菌 反丁烯二酸制造天冬氨酸
纤维素酶
木霉、青霉
食品、发酵、饲料加工
一、酶在食品保鲜方面的应用
淀粉酶
蛋白酶 脂肪酶 纤维素酶 溶菌酶 尿激酶 链激酶 青霉素酶
胰脏、麦芽、微生物
胰脏、胃、植物、微生物 胰脏、微生物 霉菌 蛋清、细菌 人尿 链球菌 蜡状芽孢杆菌
治疗消化不良，食欲不振
治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组 织，促进创伤愈合，降低血压 治疗消化不良，食欲不振 治疗消化不良，食欲不振 治疗各种细菌性和病毒性疾病 治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血 治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折 治疗青霉素引起的变态反应
8.2 酶在食品方面的应用
表8-1酶在食品方面的应用-1 酶
-淀粉酶 -淀粉酶
来
源
主要用途
发酵原料淀粉液化、制造葡萄糖、 饴糖、果葡糖浆、纺织品退浆 制造麦芽，啤酒酿造
枯草杆菌、曲霉、黑曲霉 麦芽、巨大芽孢杆菌、 多粘芽孢杆菌
糖化酶
异淀粉酶 蛋白酶 右旋糖酐酶
根霉、黑曲霉、红曲霉、 内孢霉
气杆菌、假单胞杆菌 胰脏、木瓜、 枯草杆菌、霉菌 霉菌 Nhomakorabea
执行具体的生理功能-唾液、胃液中的消化酶，凝血 酶等 清除有害物质,起保卫作用-过氧化物酶，朝氧化物岐 化酶等 协同激素等生理活性物质在体内发挥信号转换,传递 与放大作用,调节生理功能-蛋白激酶 催化代谢反应,建立各种各样代谢体系与代谢途径-葡 萄糖、氨基酸、核酸代谢
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一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别
动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
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（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。
动植物、微生物细胞的培养比较
微生物
大 小 悬浮生长 1-10 可以
动物细胞
植物细胞
10-100 多数细胞需附着 表面才能生长 非常复杂 营养要求 简单 生长速率 快，倍增时 慢，倍增时间 间0.5-5小时 15-100小时 内部、激素 内部 代谢调节 非常敏感 不敏感 环境敏感 有 无 细胞分化 非常高 低 剪切应力敏感 不常使用 传统变异，筛选 广泛使用 技术 低 细胞或产物浓度 较高
目前植物细胞发酵产酶概况:
表3-1 植物细胞发酵产酶
酶
糖苷酶 β-半乳糖苷酶 漆酶 过氧化物酶 β-葡萄糖苷酶 酸性转化酶 碱性转化酶 糖化酶 木瓜蛋白酶 苯丙氨酸氨裂合酶
植物细胞
（年份）
胡萝卜细胞 （1981） 紫苜宿细胞 （1982） 假挪威槭细胞 （1983） 甜菜细胞 （1983） 大豆细胞 （1989） 利马豆细胞 （1987） 甜菜细胞 （1988） 甜菜细胞 （1988） 甜菜细胞 （1988） 木瓜细胞 （1990） 花生细胞 （1986） 大豆细胞 （1989）
植物細胞的构造
細胞壁 覆盖在細胞膜外，由 • 和動物細胞相似 (Cell Wall) 纤维素构成，虽然厚 但可让物质自由穿过。 細胞膜 (Cell 功能：1.支持細胞，使 membrane) 細胞质 它有固定形状。2.保护 (Cytoplasm) 細胞
植物細胞通常有 液泡(Vacuole) 许多植物細胞 较大的液泡 都含有叶綠体； 叶綠体(Chloroplast) 內有綠色的叶 如淀粉颗粒和不 固体顆粒 綠素，钠负吸 (Solid granule) 溶解的废物 收光能，进行 线粒体 光合行用
back
（二）植物细胞培养的培养基
需要大量无机盐，除P、S、K、Ca、Mg外， 还需B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、I 需要各种维生素和植物激素，如硫胺素、吡哆 素、烟酸、肌醇、激动素等。
Six major groups of plant hormones : 1, AUXINS 茁长素;2, CYTOKININS细胞分裂素; 3, GIBBERELLINS 赤霉素;4, ABSCISIC ACID 脱落酸; 5, ETHYLENE 乙烯;6, BRASSINOSTEROIDS 苔云素
細胞核 (Nucleus)
(Mitochondrion)
一、植物细胞的特性
表2-2 微生物、植物、动物细胞的特性比较 （P78）
微生物细胞 细胞大小（μm） 倍增时间（h） 营养要求 对剪切力 1~10 0.3~6 简单 大多数不敏感
植物细胞 20~300 >12 简单 敏感
动物细胞 10~100 >15 复杂 敏感
第三章 动、植物细胞发酵产酶
80年代以来，生物工程研究和开发的新领域。 动物细胞通过离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化 等获得； 培养方式有悬浮培养、贴壁培养、微载体培养； 获得疫苗、激素、多肽、单抗等； 植物细胞通过捣碎、酶解、愈伤组织诱导获得； 培养方式有固体培养、液体层培养、悬浮培养等； 主产色素、药物、香精、酶等。
三、植物细胞培养的工艺条件及其控制
（一）植物细胞培养的工艺流程
外植体
细胞 获取
细胞 培养
分离 纯化
产物
go
1、外植体的选择与处理
从植株取出，预处理后用于植物组织 细胞培养的片段或小块； 选择无病虫害，生长旺盛的植株； 切成小块，消毒，漂洗
2、植物细胞的获取
（１）直接分离法，有机械法、酶解法； （２）愈伤组织诱导法； （３）原生质体再生法
10-100 可以，但易结团， 无单个细胞 较复杂 慢，倍增时间 24-74小时 内部、激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用 低
第一节
植物细胞培养产酶
从中得到最普遍而必不可少的药物有17类； 全世界用其制备天然芳香化合物的价值超过 15亿＄/年； 美国用其生产药物超过30亿＄/年； 我国使用的中草药及其制备大部分来自植物。 植物来源的物质生产几乎采用提取分离法， 如从木瓜中提取木瓜蛋白酶； 1902，Haberlandt提出分离植物单细胞培养 成株的设想，至今已成为专门学科。 通过植物细胞产酶的进展：表3-1
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内 清除超氧化物阴离子自由基(O 2—)的重要金属酶类。它和过氧 化氢酶、过氧化物酶一起构成了 生物体内重要的酶促反应防御体 系，从而维护生物体内细胞正常 的生理代谢和生化反应。衰老自 由基学说认为衰老源于机体正常 代谢过程中产生过量的自由基对 机体损害的结果。超氧化物歧化 酶(SOD)作为能催化超氧阴离子发 生歧化反应的自由基清除剂，具 有延缓衰老的作用。