南京林业大学酶工程-3 动、植物细胞发酵产酶讲解

一般为无机氮源。 一般以蔗糖为碳源。
植物细胞培养的工艺条件及其控制（续）
（三）温度的控制 室温（25℃）、 （四）pH值的控制 微酸性（pH5～6） （五）溶解氧的调节控制 代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜强烈。 （六）光照的控制 （七）前体的添加 提高次级代谢物的产量。 （八）刺激剂(electior)的应用 强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞 壁碎片和胞外酶。
动、植物细胞培养与微生物培养区别

动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固 体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨 基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血 清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪 切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测 和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细 胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养 产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的 培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。
紫草宁及其结构
植物细胞培养的特点（续）
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（2）缩短周期 发酵周期10～30天，种植周期几个月～几年。 （3）易于管理 减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。 （4）提高产品质量 主要产物浓度高，易于分离纯化，减少环境中各种有 害物质污染和侵蚀。 （5）其它 生物反应器的设计工艺条件注意的问题。
主要产物
醇类，有机酸， 色素，香精， 激素，疫苗， 氨基酸，抗生素， 药物，酶 单克隆抗体， 酶，核苷酸 酶
二、植物细胞培养的特点
（1）提高产率
例如,紫草宁(shikonin) 生产，发酵细胞中的紫 草宁比 紫菜根 (Lithospermum erythrorhizon)中高10 倍，比产率达到种植紫 草的830倍。

动植物、微生物细胞的培养比较
微生物
大 小 悬浮生长 1-10 可以
动物细胞
植物细胞
10-100 多数细胞需附着 表面才能生长 非常复杂 营养要求 简单 生长速率 快，倍增时 慢，倍增时间 间0.5-5小时 15-100小时 内部、激素 内部 代谢调节 非常敏感 不敏感 环境敏感 有 无 细胞分化 非常高 低 剪切应力敏感 不常使用 传统变异，筛选 广泛使用 技术 低 细胞或产物浓度 较高
目前植物细胞发酵产酶概况:
表3-1 植物细胞发酵产酶
酶
糖苷酶 β-半乳糖苷酶 漆酶 过氧化物酶 β-葡萄糖苷酶 酸性转化酶 碱性转化酶 糖化酶 木瓜蛋白酶 苯丙氨酸氨裂合酶
植物细胞
（年份）
胡萝卜细胞 （1981） 紫苜宿细胞 （1982） 假挪威槭细胞 （1983） 甜菜细胞 （1983） 大豆细胞 （1989） 利马豆细胞 （1987） 甜菜细胞 （1988） 甜菜细胞 （1988） 甜菜细胞 （1988） 木瓜细胞 （1990） 花生细胞 （1986） 大豆细胞 （1989）
植物細胞的构造
細胞壁 覆盖在細胞膜外，由 • 和動物細胞相似 (Cell Wall) 纤维素构成，虽然厚 但可让物质自由穿过。 細胞膜 (Cell 功能：1.支持細胞，使 membrane) 細胞质 它有固定形状。2.保护 (Cytoplasm) 細胞
植物細胞通常有 液泡(Vacuole) 许多植物細胞 较大的液泡 都含有叶綠体； 叶綠体(Chloroplast) 內有綠色的叶 如淀粉颗粒和不 固体顆粒 綠素，钠负吸 (Solid granule) 溶解的废物 收光能，进行 线粒体 光合行用

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（二）植物细胞培养的培养基
需要大量无机盐，除P、S、K、Ca、Mg外， 还需B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、I 需要各种维生素和植物激素，如硫胺素、吡哆 素、烟酸、肌醇、激动素等。
Six major groups of plant hormones : 1, AUXINS 茁长素;2, CYTOKININS细胞分裂素; 3, GIBBERELLINS 赤霉素;4, ABSCISIC ACID 脱落酸; 5, ETHYLENE 乙烯;6, BRASSINOSTEROIDS 苔云素
細胞核 (Nucleus)
(Mitochondrion)
一、植物细胞的特性
表2-2 微生物、植物、动物细胞的特性比较 （P78）
微生物细胞 细胞大小（μm） 倍增时间（h） 营养要求 对剪切力 1~10 0.3~6 简单 大多数不敏感
植物细胞 20~300 >12 简单 敏感
动物细胞 10~100 >15 复杂 敏感
第三章 动、植物细胞发酵产酶
80年代以来，生物工程研究和开发的新领域。 动物细胞通过离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化 等获得； 培养方式有悬浮培养、贴壁培养、微载体培养； 获得疫苗、激素、多肽、单抗等； 植物细胞通过捣碎、酶解、愈伤组织诱导获得； 培养方式有固体培养、液体层培养、悬浮培养等； 主产色素、药物、香精、酶等。
三、植物细胞培养的工艺条件及其控制
（一）植物细胞培养的工艺流程
外植体
细胞 获取
细胞 培养
分离 纯化
产物
go
1、外植体的选择与处理
从植株取出，预处理后用于植物组织 细胞培养的片段或小块； 选择无病虫害，生长旺盛的植株； 切成小块，消毒，漂洗

2、植物细胞的获取
（１）直接分离法，有机械法、酶解法； （２）愈伤组织诱导法； （３）原生质体再生法
10-100 可以，但易结团， 无单个细胞 较复杂 慢，倍增时间 24-74小时 内部、激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用 低
第一节
植物细胞培养产酶
从中得到最普遍而必不可少的药物有17类； 全世界用其制备天然芳香化合物的价值超过 15亿＄/年； 美国用其生产药物超过30亿＄/年； 我国使用的中草药及其制备大部分来自植物。 植物来源的物质生产几乎采用提取分离法， 如从木瓜中提取木瓜蛋白酶； 1902，Haberlandt提出分离植物单细胞培养 成株的设想，至今已成为专门学科。 通过植物细胞产酶的进展：表3-1
四、植物细胞培养产酶的工艺过程
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内 清除超氧化物阴离子自由基(O 2—)的重要金属酶类。它和过氧 化氢酶、过氧化物酶一起构成了 生物体内重要的酶促反应防御体 系，从而维护生物体内细胞正常 的生理代谢和生化反应。衰老自 由基学说认为衰老源于机体正常 代谢过程中产生过量的自由基对 机体损害的结果。超氧化物歧化 酶(SOD)作为能催化超氧阴离子发 生歧化反应的自由基清除剂，具 有延缓衰老的作用。