生物抗菌肽研究进展及应用前景

・综述・生物抗菌肽研究进展及应用前景
周义文综述　尹一兵　涂植光审校
【摘要】　生物抗菌肽(antibacterial peptides)广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内,有非特异性抗
细菌、真菌、病毒和肿瘤细胞的作用,又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。

抗菌肽是通过其两亲性正
电荷与细菌细胞膜磷脂分子负电荷的静电吸引而结合在细菌膜上,疏水端插入细胞膜中,最终通过膜
内分子间的位移而聚集在一起形成离子通道,使细菌失去膜电势,不能维持正常渗透压而死亡。

抗菌
肽杀菌力强,抗菌谱广,不良反应少,将会给临床医学、临床药学、食品防腐、动植物转基因等领域带来
广阔的开发应用前景。

【关键词】　生物抗菌,肽;　抗菌机制;　分子结构
自从青霉素被发现以来,人们对病原菌引起的感染性疾病不再束手无策,特别是β2内酰胺类抗生素的发现,对病原菌感染性疾病的治疗产生了革命性飞跃,抗生素已成为临床治疗病原菌感染的强有力武器。

但是,随着抗菌药物的广泛应用和滥用,耐药菌株不断增加,使抗感染治疗陷入耐药菌危机之中。

为了应对耐药菌感染,人们一方面对传统抗生素进行结构改造降低细菌的耐药性,另一方面正在不断研究和开发新型抗菌药物。

近年来出现的抗菌肽(antibacte2 rial peptides)就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物,它是宿主产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子阳离子肽[1,2]
,广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内,除有非特异性抗细菌、真菌、病毒等病原体作用外[3,4],还有抗肿瘤细胞作用,因此又称为肽抗生素(peptide antibiotics)。

抗菌肽抗菌谱广,对多重耐药菌、肿瘤细胞、艾滋病毒有杀伤作用,甚至还可能有抗重症急性呼吸综合征(severe acute kespiratory syn2 drome,SARS)病毒的作用。

因此有着广阔的开发应用前景,是目前国际学术研究的活跃领域之一。

抗菌肽的分类及功能特征
抗菌肽最早由瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕(hyatophora cecropia)蛹中诱导分离出来,被称为天蚕素(cecropin)。

随着人们研究的深入,又陆续发现cecropin A、B、C、D等亚型,并相继在其他昆虫、哺乳动物、两栖动物以及植物中分离到了cecropin类似物。

抗菌肽的结构与功能密切相关,来自不同物种的抗菌肽分子结构有一定的差别,因此生物学功能及活性也有一定的差异。

其分子构型不论是α2螺旋或是β2折叠,都有一个共同的特性就是都具有两亲性。

按分子结构及功能特征可将其分为4类。

11α2螺旋结构类:此类抗菌肽分子量约4kD,不含半胱氨酸,不形成分子内二硫键,N2末端区域富含亲水性碱性氨基酸残基,如赖氨酸和精氨酸,所带正电荷有利于与细菌膜上的酸性磷脂头负电荷作用而吸附到细菌膜上;C末端含较多的疏水性氨基酸残基,疏水性的尾部有利于抗菌肽插入细菌膜的双层脂质膜中。

分子的两端各形成一个两亲性α2螺旋,两个α2螺旋之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区,这种α螺旋是破坏、裂解细菌的主要结构,当抗菌肽结合到细菌细胞膜上时,α螺旋相互聚集使细胞膜形成孔洞,细胞质外溢而致细菌死亡。

若减少抗菌肽的α螺旋,其破坏细胞膜的能力降低,用圆二色谱法研究抗菌肽的高级结构发现,cecropin A的第1～11位氨基酸残基有很强的形成α螺旋倾向。

抗菌肽在磷酸盐缓冲液中呈自由卷曲的构象,加入六氟丙醇降低溶液的极性以模拟细胞膜的疏水环境时,抗菌肽的α螺旋数量明显增多,这说明抗菌肽只是在结合或接近细胞膜时才形成发挥功能的高级结构。

天蚕素是α2螺旋结构,广泛存在于昆虫体内,如家蚕、柞蚕、果蝇、麻蝇、伊蚊等,目前已从昆虫体内发现20多种cecropin类似物,如从果蝇分离出的an2 dropin,从麻蝇分离出的sarcotoxinⅠ和Ⅱ等,还有从猪小肠、双卷螺等分离出的cecropin的报道。

cecropin 对革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌均具有杀伤力[5]。

爪蟾抗菌肽(magainins)也是一类具有两亲性α2螺旋的抗菌肽,存在于蛙的皮肤和胃中。

21伸展性螺旋结构类:该类抗菌肽不含半胱氨酸,但富含脯氨酸和/或精氨酸或色氨酸等,由15～34个氨基酸残基组成,在两性分子内部形成分子内的α螺旋。

如从蜜蜂体内分离到的apidaecins中脯氨酸和精氨酸的含量分别高达33%和17%。

从果蝇分离到的dorsocin在分子结构上与apidaecins具有一定的相似性。

昆虫防御素首先从肉蝇(phormia terranovae)中分离得到,当时认为与哺乳动物的防御素具有高度同源性而命名为昆虫防御素(insect defensin)。

但研究
作者单位:400016重庆医科大学检验医学系
表明昆虫防御素与哺乳动物防御素二硫键的连接方式以及三维空间构型是截然不同的,因而昆虫防御素与哺乳动物防御素不具有同源性。

后来又从麻蝇(sarcophaga peregrina)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、按蚊(Anopheles gambiae)、果蝇、人的腮腺及牛中性粒细胞等分离到防御素家族成员。

31环链结构类:该类抗菌肽在C2末端有一个分子内二硫键,在C2末端形成一个环链结构(loop struc2 ture),而N2末端为线状结构。

如青蛙皮肤细胞产生的brevinins和bactenecin属于此类。

而牛中性粒细胞分泌的bactenecin是在分子的中部形成一个环链,两端有一个或两个游离的残基[6]。

这一类抗菌肽有较强的抗菌活性。

41β2折叠型:该类抗菌肽是在分子内有2～6个二硫键的抗菌肽类,分子量约为4～6kD。

有代表性的是动物防御素(animal defensin),可分为α型和β型两种。

α2防御素已从人的中性粒细胞、兔的巨噬细胞、鼠和人的小肠Paneth细胞中分离到[7],一般含有29～34个氨基酸残基,可形成3个β2片层结构,通过Cys12 Cys6、Cys22Cys4、Cys32Cys5方式形成的3个二硫键、Arg26与G lu224之间的盐键及每个单体中Cys、Tyr 和Phe残基间的相互疏水作用,保证了二聚体空间结构的稳定性。

β2防御素广泛存在于不同的上皮组织中,可能参与上皮和粘膜的抗感染防御[1,2,8],一般含有38～42个氨基酸残基,是通过Cys12Cys5、Cys22 Cys4和Cys32Cys6的方式形成二硫键。

X2射线晶体衍射研究人嗜中性粒细胞中分离到的防御素(HNP23)的结构发现,在晶体状态下,防御素是以二聚体形式存在。

每个单体都有三股反平行的β2折叠片以二硫键连接。

不对称的两个单体分子紧密靠近,并对二次旋转轴对称。

两个单聚体之间以四个直接氢键和两个通过定向水分子构成的氢键连接。

每个单体中的Cys、Tyr和Phe残基间的疏水相互作用,以保证二聚体结构的稳定性。

HNP23的β2折叠结构可能适用于所有其他来源的防御素。

抗菌肽的抗菌机制
抗菌肽的抗菌机制与传统抗生素有所不同,传统抗生素是与病原体特定部位的受体结合从而使病原体的正常结构遭到破坏或使某些生物合成受阻,以达到抑菌或杀菌的作用,当其作用的靶位点发生改变时,抗生素就会失去其抗菌作用;生物抗菌肽则是以物理的方式作用于细菌的细胞膜,使细胞膜穿孔,细胞质外溢而达到杀菌的目的[9]。

由于抗菌肽均具有疏水和亲水的两亲性特征,带正电荷的分子与细胞膜磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在细胞的磷脂膜上,随后抗菌肽分子的疏水端插入细菌细胞膜的脂质膜中,进而牵引整个分子进入质膜,扰乱质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序,再通过抗菌肽分子间的相互位移而聚合形成跨膜离子通道,细胞质外流,细胞内离子大量丢失,细菌不能维持生命活动所需的胞内渗透压而死亡。

不论是α螺旋结构、伸展性螺旋结构、环链结构,还是β2折叠构型,膜通道的形成能力对抗菌肽的抗菌活性都起着决定性的作用。

有意义的是,抗菌肽只对原核生物细胞产生特异性的溶菌活性,对最低等的真核生物如真菌及某些植物的原生质体、某些肿瘤细胞等也有一定的杀伤力,而对人体正常的细胞则无损伤作用。

原因在于原核细胞和真核细胞结构尤其是膜结构的不同,真核细胞质膜含有丰富的膜蛋白和胆固醇,特别是后者的存在,使细胞膜趋于稳定,而且哺乳动物细胞中还存在高度发达的细胞骨架系统,其中的微丝、微管与质膜内层有着许多结合位点,这种结构是细胞维持特殊形态和渗透压的首要因素,它的存在抵抗了抗菌肽的溶菌作用。

用细胞松弛素(cytochalasin)将哺乳动物细胞中的骨架结构去除后,此细胞对抗菌肽的溶菌作用很敏感。

许多癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比是不发达的,所以对正常细胞无毒性浓度的抗菌肽可以杀死许多癌细胞株。

Okada等研究发现,用麻蝇素Ⅰ(sarcotoxinⅠ)处理大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)后,E.coli对脯氨酸和四苯基磷酸盐的吸收停止,而这些物质的膜间运输需要膜间的电化学势。

进一步研究发现sarcotoxin Ⅰ扮演着离子泵的角色,它使得细胞内的钾离子快速地外流,三磷酸腺苷的含量急速下降。

这些现象也提示sarcotoxinⅠ的抗菌作用也是在细菌的细胞膜上形成孔道,造成细胞内物质泄漏而导致细胞电化学势的丧失。

为了进一步证实这一点,Nakajima等用sarco2 toxinⅠA与酸性磷脂制备的脂质体作用,发现包在脂质体里的葡萄糖分子被释放了出来,并发现sarcotoxin ⅠA与不同磷脂组成的脂质体相互作用,磷脂头的酸性愈强,抗菌肽对它的作用效应也愈强,当磷脂体中含有胆固醇时,其作用效应明显降低。

胆固醇是真核细胞膜的固有成分,所以这可能是抗菌肽只作用于原核细胞而对真核细胞无效或作用甚微的重要原因。

实验表明脂质体对抗菌肽的敏感度随着脂质体所带电荷的减少而降低。

这就证实了抗菌肽与细菌细胞膜表面的静电吸附是抗菌肽裂解细菌的第一步;而随着疏水末端的插入、抗菌肽分子的相互位移,最终聚合形成离子通道,是抗菌肽裂解细菌的关键。

抗菌肽的生物学活性
11广谱抗菌活性:抗菌肽的抗菌谱较传统抗生素宽,传统抗生素通常只对细菌有效,而对真菌、病毒等病原体无效。

来自昆虫、猪、蛙、人等的抗菌肽既有抗革兰阴性菌和革兰阳性菌作用,又有抗真菌、抗病毒
作用[3,5,10]。

抗菌肽不仅自身具有良好的抗菌活性,不同抗菌肽或与传统抗生素联用,还可提高抗菌肽和传统抗生素的药物疗效,甚至拓宽传统抗生素的抗菌谱。

这也是近年来对抗菌肽研究中的一个新发现。

实验结果表明抗菌肽synerporin S210和synerporin L SB21与替卡西林联用能明显提高替卡西林的抗菌活性,使替卡西林对E.Coli和铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,M IC)降低。

synerporin C2与抗真菌药物联用,可明显降低两性霉素B和制霉菌素的用药量,既达到治疗目的,又减少了用药量,降低了抗真菌药物的毒性副反应,可谓是一个很有实用价值的新发现。

21抗病毒活性:研究发现烟芽夜蛾幼虫的血淋巴对多种DNA、RNA病毒有明显的抑制作用,使病毒的感染力降低。

人中性粒细胞防御素HNP21对疱疹病毒有抑制作用。

更值得注意的是,Wachinger M等[11]的研究结果表明,蜂毒素和天蚕素可以在亚毒性浓度下抑制爱滋病毒HIV21的基因表达,减少HIV21的增殖。

这是一个值得深入探讨的有价值的课题。

31抗肿瘤活性:肿瘤细胞的细胞骨架系统不发达,抗菌肽易插入细胞脂膜形成离子通道,破坏肿瘤细胞。

1μg/ml的人源性抗菌肽与肿瘤细胞作用14h 有明显的杀瘤作用。

天蚕素、爪蛙素、鼠抗菌肽NP21和NP22及人抗菌肽HNP21均表现出对肿瘤细胞如纤维瘤细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞等的杀伤活性。

41促进伤口愈合:抗菌肽能刺激纤维母细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞的增殖,促进创面肉芽组织的增生,加快创面的愈合。

分别用抗菌肽cytoporin和磺胺嘧啶银制成的软膏治疗小鼠烧伤,cytoporin组愈合快,疤痕小,磺胺嘧啶银组虽然创面感染得到了控制,但创面愈合较慢,疤痕也大。

抗菌肽的开发应用前景
由于天然抗菌肽具有抗细菌、真菌、病毒和肿瘤细胞而不破坏人体正常细胞的特殊功效,如能很好地开发利用,有望给临床医学、临床药学、食品加工、动物和植物转基因技术等领域带来广阔的开发利用前景。

不同种类抗菌肽其抗菌活性和抗菌谱既有相似之处,也存在很大的差异[12],因此寻找高效广谱的生物抗菌肽,一直是广大临床医生和科研工作者努力的方向。

在临床上,可用于治疗外伤感染、褥疮和不宜用抗生素的感染性患者。

美国的Helix BioMedix公司正在对天蚕抗菌肽的突变体cytoporins进行临床应用研究。

加拿大的IntraBiotics公司利用从蚕或牛分离到的protegrin1开发出一种抗细菌和真菌的iseganan HCL oral solution,通过喷雾用于呼吸道感染及口腔粘膜炎的治疗,取得了较为满意的疗效[13,14]。

在食品加工领域,可用于绿色食品的防腐剂,减少有害防腐剂的应用。

在转基因技术方面,可将强效抗菌肽基因转入植物或动物以增强其抗病能力。

相信在不久的将来,天然抗菌肽必将极大地造福于人类。

参　考　文　献
1Milner SM,Ortega MR.Reduced antimicrobial peptide expression in human burn wounds.Burns,1999,25(5):4112413.
2Bals R,Wang X,Meegalla RL,et al.Mouse beta2defensin3is an in2 ducible antimicrobial peptide expressed in the epithelia of multiple or2 gans.Infect Immun,1999,67(7):354223547.
3Bellm L,Lehrer RI,G anz T.Protegrins:new antibiotics of mammalian origin.Expert Opin Investig Drugs,2000,9(8):173121742.
4Hancock RE.Cationic antimicrobial peptides:towards clinical applica2 tions.Expert Opin Investig Drugs,2000,9(8):172321729.
5Andra J,Berninghausen O,Leippe M.Cecropins,antibacterial peptides from insects and mammals,are potently fungicidal against Candida albi2 cans.Med Microbiol Immunol(Berl),2001,189(3):1692173.
6Wu M,Hancock RE.Improved derivatives of bactenecin,a cyclic dode2 cameric antimicrobial cationic peptide.Antimicrob Agents Chemother, 1999,43(5):127421276.
7Yamaguchi Y,Nagase T,Makita R,et al.Identification of multiple nov2 el epididymis2specific beta2defensin isoforms in humans and mice.J Im2 munol,2002,169(5):251622523.
8Hiratsuka T,Nakazato M,Ihi T,et al.Structural analysis of human be2 ta2defensin21and its significance in urinary tract infection.Nephron, 2000,85(1):34240.
9Lee D G,Park Y,K im HN,et al.Antifungal mechanism of an antimicro2 bial peptide,HP(22220),derived from N2terminus of Helicobacter py2 lori ribosomal protein L1against Candida albicans.Biochem Biophys Res Commun,2002,291(4):100621013.
10Ekengren S,Hultmark D.Drosophila cecropin as an antifungal agent.
Insect Biochem Mol Biol,1999,29(11):9652972.
11Wachinger M,K leinschmidt A,Winder D,et al.Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus1by suppressing viral gene expression.J G en Virol,1998,79(Pt
4):7312740.
12Blazyk J,Wiegand R,K lein J,et al.A novel linear amphipathic beta2 sheet cationic antimicrobial peptide with enhanced selectivity for bacte2 rial lipids.J Biol Chem,2001,276(30):27899227906.
13Toney J H.Iseganan(IntraBiotics pharmaceuticals).Curr Opin Investig Drugs,2002,3(2):2252228.
14Chen J,Falla TJ,Liu H,et al.Development of protegrins for the treat2 ment and prevention of oral mucositis:structure2activity relationships of synthetic protegrin analogues.Biopolymers,2000,55(1):88298.
(收稿日期:2003207228)。