美拉德反应的抗氧化性、褐变及荧光性

1. 美拉德反应

1.1 简介

美拉德反应( Maillard Reaction，MR) 是羰基化合物(尤其是还原糖)与氨基化合物(氨基酸、肽类、蛋白质等) 发生的一系列复杂的非酶促褐变反应，也被称为羰氨反应。该反应最早由法国化学家美拉德(Maillard)于20世纪初发现,当他把甘氨酸与葡萄糖的混合物加热时，发现形成了褐色的类黑精，此类反应即被称为美拉德反应(Maillard Reaction)。

美拉德反应在近几十年来一直是食品化学、食品工艺学、营养学、香料化学等领域的研究热点。因为美拉德反应是加工食品色泽和浓郁芳香的各种风味的主要来源，特别是对于一些传统的加工工艺过程如咖啡、可可豆的焙炒，饼干、面包的烘烤以及肉类食品的蒸煮。另外，美拉德反应对食品的营养价值也有重要的影响，既可能由于消耗了食品中的营养成分或降低了食品的可消化性而降低食品的营养价值，也可能在加工过程中生成抗氧化物质而增加其营养价值。对美拉德反应的机理进行深入的研究，有利于在食品贮藏与加工的过程中，控制食品的色泽、香味的变化或使其反应向着有利于色泽、香味生成的方向进行，减少营养价值的损失，增加有益产物的积累，从而提高食品的品质。

1.2 美拉德反应对食品的影响

⑴色泽：一般来说，将食品加热或将食品长期贮藏就会产生类黑精褐色色素。含有类黑精的食品有很多，如面包、烤肉、烤鱼、咖啡、麦茶等。而酱油、豆酱等调味品中褐色色素的形成也是因为美拉德反应，这种反应也称为非酶褐变反应。这些食品经加工后会产生非常诱人的金黄色至深褐色，增加人们的食欲。

在奶与奶制品的加工与贮藏中也会发生非酶褐变，基本过程是：酪蛋白末端氨基酸赖氨酸的氨基与乳糖（或其他糖类）的羰基发生反应，生成氨代葡萄糖胺，然后通过Amadori分子重排，再经裂解、脱水等过程而生成棕褐色物质。但这种褐变却不是人们所期望的，而是食品厂家所要极力避免的。在面包生产的上色工序中，色泽变化的基础物质是含有还原基的糖与含有氨基的化合物。添加不同的氨基酸与糖类，可使面包表皮产生金黄色、黄色、明亮的褐色以及深褐色。在生产上可用控制还原糖的量来调节褐变的程度，也可用增减氨基酸的量来控制。

另外，在焦糖色素生产工艺中也应用到美拉德反应，这种工艺是在糖质原料中加入一定量的含氨基化合物) 如氨、铵盐、氨基酸等，在125～140℃下使之进行反应生产焦糖色素。

⑵香气：天然食品香气物质的来源主要有两个方面：一是在动植物生长或加工过程中，由酶促反应形成的食品香味料，如苹果、香蕉、蔬菜中的芳香物；二是食品在蒸煮、焙烤及煎炸中产生的食品香料，即食物经加热而分解、氧化、重排或降解，形成香味前体，进而生成具有特殊风味的食品香料，一般称之为热加工食品香料，亦叫反应食品香料，如烤面包、爆花生米、炒咖啡等所形成的香气物质。这类香气物质形成的化学机理就是美拉德反应。

酱香型白酒香味物质的产生、风格的形成，也是美拉德反应的结果。酱香型白酒的高温大曲的制作及酿酒发酵过程，均在微酸或偏酸的条件下进行，因而Amadori化合物主要发生1,2-烯醇化，而2,3-烯醇化则较缓慢，即反应产物主要是呋喃类衍生物—糠醛类风味成分，而吡喃酮等特征组分含量则较少。美拉德反应所产生的糠醛类、酮醛法、二羰基化合物、吡喃类及吡嗪类化合物，对酱香酒风格的形成起着决定性作用。

食品原料一般都含有还原糖、淀粉、氨基酸。这些物质在加热中生成的香味物质与加热温度和加热时间等条件有关。食品在加热过程中所发生的美拉德反应包括氧化、脱羧、缩合和环化反应，可产生各种香味特征的香味物质，如含氧、含氮和含硫杂环化合物，包括氧杂环的呋喃类，氮杂环的吡嗪类，含硫杂环的噻吩和噻唑类，同时也生成硫化氢和氨。选用不种的氨基酸和糖在不同的温度、时间等条件下，反应可有目的性获得含有吡嗪类、吡咯类、呋喃类等不同香型的香味料。

美拉德反应所形成的香精具天然肉类香精的逼真效果，具有调配技术无法比拟的作用。美拉德反应技术在香精领域中的应用打破了传统的香精调配和生产工艺的范畴，是一全新的香精香料生产应用技术，其特殊的风味意义使得它尤其是在肉类香精及烟草香精中有非常好的应用。

⑶营养：美拉德反应对食品营养的影响包括降低蛋白质的营养质量、蛋白质改性以及抑制胰蛋白酶活性等。对于粮食制品，美拉德反应无疑会使其蛋白质的生物价更低。有人报道，200℃烘烤15min的糕点，其蛋白质的PER值由烘烤前的3.6降至2.4，若继续在130℃烘烤1h，则会进一步降至0.8，这是由于赖氨酸减少而引起的。加热还影响胱氨酸、色氨酸、精氨酸的利用率。

奶与奶制品中的氨基酸因形成色素复合物和在斯特勒克降解反应中被破坏而造成损失。色素复合物以及与糖结合的酪蛋白不易被酶所分解，因而降低了氮的利用率。组成蛋白质的所有氨基酸中，赖氨酸损失是最大的。因为它的游离氨基最易和羰基相结合。由于赖氨酸是许多蛋白质中的限制性氨基酸，因而它的损

失较大地影响了蛋白质的营养质量。

⑷抗氧化性的产生，美拉德反应中产生的褐变色素对油脂类自动氧化表现出抗氧化性，这主要是由于褐变反应中生成醛、酮等还原性中间产物

⑸抗突变。

1.2 美拉德反应的影响因素

⑴糖氨基结构：还原糖是美拉德反应的主要物质，五碳糖褐变速度是六碳糖的10倍，还原性单糖中五碳糖褐变速度排序为：核糖>阿拉伯糖>木糖，六碳糖则：半乳糖>甘露糖>葡萄糖。还原性双糖分子量大，反应速度较慢。在羰基化合物中，α-乙烯醛褐变最慢，其次是α-双糖基化合物，酮类最慢。胺类褐变速度快于氨基酸。在氨基酸中，碱性氨基酸速度慢，氨基酸比蛋白质慢。

⑵温度：温度20～25℃氧化即可发生美拉德反应。一般每相差10℃，反应速度相差3～5倍。30℃以上速度加快，高于80℃时，反应速度受温度和氧气影响小。

⑶水分：水分含量在10%～15%时，反应易发生，完全干燥的食品难以发生。

⑷pH值：当pH值在3以上时，反应随pH值增加而加快。

⑸化学试剂：酸式亚硫酸盐抑制褐变，钙盐与氨基酸结合成不溶性化合物可抑制反应。

1.4 美拉德反应的抑制消除方法

美拉德反应是一个十分复杂的反应过程，中间产物众多，终产物结构十分复杂，完全抑制美拉德反应相当困难，又由于美拉德反应影响因素众多，有效抑制美拉德反应必须是多种因素协同作用的结果，一般认为可采用以下方法抑制美拉德反应：

⑴使用不易褐变的原料

⑵降低温度

⑶降低pH 值

⑷调节水分活度

⑸氧气

⑹使用氧化剂

⑺使用酶制剂等等

⑴色度

反应产物的颜色由Datacolor110-TM色差计测定，表色系统由 3 个值L*、a* 和b* 组成，L* 值表示亮度；a* 值正向越大表示颜色越接近正红色，负向越大越接近绿色；b* 值正向越大表示颜色越黄，负向越大表示颜色越蓝。测量温度20 ℃。

如图所示，随着加热时间的延长(顺时针方向)，a* 值和b* 值均先增大后减小，即体系颜色首先是黄色-棕色增加，而后随着加热时间延长体系颜色由黄色-棕色变为橘红色-棕色，继续加热体系颜色呈紫红色。

1.5 美拉德反应的研究方法

美拉德反应自年被法国化学家发现以来，由于其在食品、医药领域中的重要影响，引起了各国化学家的兴趣。但由于食品的组分太复杂，要完全搞清楚美拉德反应的机理，仍是一件难事。为了研究美拉德反应的机理，人们通常用简单的几个原料，如某种氨基酸和糖类进行模拟反应，再研究反应的产物组成及生成途径。但至今，人们只是对该反应产生低分子量物质的化学过程比较清楚，而对该反应产生的高分子聚合物的研究尚属空白。

另外，食品化学家近年来将动力学模型引入对美拉德反应的研究中。运用这种方法的优点在于不需要考虑美拉德反应复杂的反应过程，而只需要研究反应物、产物的质量平衡以及特征中间体的生成与损失来建立动力学模型，从而预测反应的速率控制点。

2. 美拉德反应的原理

美拉德反应化学，美拉德反应按其本质而言是氨羰间的加缩反应，它可以在醛、酮、还原糖及脂肪氧化生成的羰基化合物与胺、氨基酸、肽、蛋白质甚至氨之间发生反应，其化学过程十分复杂。关于美拉德反应的反应过程，一般可分为三个反应阶段、三条反应路线。

2.1 初级美拉德反应阶段

还原糖的羰基与氨基之间进行加成，加成后失去一分子水而转化为希夫碱，经Amadori 重排为1-氨基-1-脱氧-2-酮糖，称谓阿马多利化合物，它不产生食品香味，是极其重要的不挥发性的香味前驱物质。

2.2 高级美拉德反应阶段

高级的美拉德反应包括下列的三条反应路线。

2.2.1 还原酮路线

由阿马多利化合物在2～3 位下不可逆烯醇化，从C1消去胺基生成甲基二羰基中间体，进一步生成5-羟基麦芽酚或甲基醛类、酮醛类、二羰基化合物等裂解产物。

2.2.2 Osulose 路线

阿马多利化合物在1～2 位置上烯醇化，消去C3上的羟基，水解成3-脱氧己酮糖，然后脱水生成糠醛类风味成份。

2.2.3 Strecker 降解

α-氨基酸和α-二羰基化合物反应，失去一分子CO2而降解成为少一个碳原子的醛类及烯醇胺。烯醇胺进一步缩合、脱氢而生成吡嗪衍生物

经过高级反应阶段，美拉德反应产物可分为三大类：(1)吡喃类衍生物与酮醛类；(2)呋喃类衍生物；(3)醛及吡嗪类衍生物。这些化合物是各类食品中极为重要的风味成份。

2.3 最终反应阶段

在最终反应阶段，由高级美拉德反应阶段形成的众多活性中间体，如葡萄糖酮醛、3-脱氧O sulose(3-DG)、3,4-二脱氧Osulose (3,4-二DG)、HMF、还原酮类、不饱和醛亚胺等等，又可继续与氨基酸反应，最终都生成类黑精色素——褐色含氮色素，此过程包括醇醛缩合、醛氨聚合、环化合反应等。

最终反应阶段的反应途径尚未清楚，生成的色素称为黑色素(类黑精类物质),无特定分子结构，是分子量相当高的含氮含氧化合物，有着各种各样的构成单位。但是，褐色色素不是由单一构成单位重复构成，而是由不同构成单位构成的非常复杂的结构。

3.美拉德反应的抗氧化性与褐变及荧光性的关系

褐变是MR最显著的特征，早期对MR 的研究主要是在色度和吸光度方面，用360～490nm 区间的特征吸收峰表征类黑素物质产生的速率和积累程度。随着对MR 研究的深入，1942 年Pearce 和Thistle 首先发现MRPs 具有一定的荧光吸收特性，并用以表征食品储存期间的变质［2］。目前，对于MRPs 中呈现褐色或荧光吸收特性的具体物质，除了少数结构被揭示外，大量仍未知。

一些研究指出MR 中荧光吸收现象先于褐变，所以，一般认为荧光吸收物质是大分子褐色物质的前体物［3］。色素物质、荧光吸收物质的产生需要一个诱导期，而荧光物质所需要的诱导时间较短。一般将荧光物质作为美拉德反应的指示剂，其可以灵敏地反映美拉德反应的早期过程［4］的复杂性和不稳定性，人们尚不完全清楚美拉德反应产物中具有抗氧化活性的是何物质。一些针对不同食品体系中MRPs 的抗氧化活性与其光学特征之间的相关性研究，也一直存在着争议。一些实验表明，葡萄糖与赖氨酸、甘氨酸的模式美拉德反应产物的抗氧化活性与颜色呈现一定的线性相关性(与褐变颜色成正比) ，并指出这是因为反应产生类黑精的缘故［5－9］。但也有学者在对MRPs 清除DPPH 自由基的研究中发现，褐变与清除效果没有关系，但荧光吸收特性与清除活性有关，认为荧光吸收可以表征清除自由基能力［10］。

3.1 美拉德反应的抗氧化性

3.1.1类黑精

类黑精主要在美拉德反应的末期阶段形成，它具有一些功能性质，例如抗氧化、抑菌和抗高血压活性[8]。

Delgado-Andrade等对从煮制咖啡中提取的类黑精的抗氧化活性物质进行了研究[9]，发现类黑精有过羟基清除活性，这主要是由于类黑精中的高分子量螯合化合物与过羟基发生螯合作用而使自由基清除。

Wagner等研究葡萄糖-甘氨酸反应产生的类黑精的可溶部分、高分子量部分、低分子量部分和不可溶部分的抗氧化活性[10]。他们向玉米油中添加类黑精的可溶部分和不可溶部分，添加量为0.01%~0.5%。结果表明，添加0.5%的可溶部分或0.5%不可溶部分都能够延长玉米油的货架期，这可能是由于类黑精和玉米油中剩余生育酚的协同作用。

3.1.2还原酮

美拉德反应的初始阶段，还原糖和氨基酸反应即可生成不稳定的氨基还原酮。MRPs中的还原酮具有还原和螯合作用，这能起到抗氧化的作用。

Gu等对酪蛋白和葡萄糖反应得到的经过超滤的MRPs的特性和抗氧化性进行研究，结果表明，反应所得的MRPs有较高的还原能力和金属螯合活性，并且高分子质量的MRPs表现出最高的还原能力和金属螯合活性[12]。

MRPs中的还原酮通过提供氢原子，打破了自由基链式反应[13]。还原酮可以与一些过氧化物的前体物反应阻止过氧化物的生成，从而达到抗氧化的目的。

马志玲等采用葡萄糖和不同氨基酸（赖氨酸和甘氨酸）发生美拉德反应制备了MRPs，并采用铁氰化钾还原法评价了MRPs的还原能力[14]。发现随加热时间的增加还原能力下降，主要原因是加热使一些还原性物质分解所造成的。MRPs 的抗氧化能力随反应时间的增加而提高，还原能力则相反，这说明抗氧化能力不完全取决于还原能力，而是与其他因素，如提供氢的能力、螯合金属离子的能力和清除活性氧的能力等有关。

3.1.3挥发性杂环化合物

美拉德反应还会产生挥发性杂环MRPs。这类物质主要是一些含氧、含氮和含硫的杂环化合物，包括氧杂环的呋喃类，氮杂环的吡嗪类，含硫杂环的噻吩和噻唑类。

Osada等从不同氨基酸和葡萄糖反应产生的MRPs中提取挥发性化合物[15]，并测定不同浓度（10、20、50、100、200和500 μg·mL-1）的挥发性化合物对己醛氧化的抑制率。结果表明浓度高于20 μg·mL-1的挥发性化合物表现出对己醛氧化的抑制作用。这类物质具有的抗氧化性可能是由于具有芳香特性的五元和六元杂环化合物中6个π电子非定域分布于环上，使碳原子上电子过剩，由于碳原子上π电子云密度提高而有助于自由基亲电加成，起到抗氧化的效果。

硫醇类的杂环化合物抗氧化机理表现在三个方面：

①亲核的硫醇基作为单电子的还原剂清除过氧或环氧自由基；

②通过电子还原作用分解过氢化物，生成二硫化物；

③五元杂环可清除活性自由基，与致香挥发性物质抗氧化性一致[16]。

3.2 美拉德反应的抗氧化性同褐变和荧光性

美拉德反应中的光学特性主要包括色度、294nm和420nm处的吸光值（294nm 处吸光值反映的是美拉德反应过程中产生的无色中间产物量的变化，420nm处的吸光值反映的则是褐变程度）以及荧光性。光学特性同抗氧化性之间的关系目前并不明确，主要有三种观点。

3.1 观点一

Soottawat Benjakul等研究了猪血浆蛋白（porcine plasma protein, PPP)和乳糖、半乳糖以及果糖体系中美拉德反应抗氧化性与光学特性的关系

得出结论：美拉德反应抗氧化性与褐变程度有较好的线性相关性。

3.2 观点二

Francisco J. Morales等研究了葡萄糖体系和乳糖体系中美拉德反应抗氧化性与光学特性的关系。

由于奎宁的硫酸盐(硫酸奎宁或重硫酒交奎宁)在0.1N硫酸溶液中产生稳定的萤光，故常利用这溶液来检查萤光计或萤光分光光度计在各个波长的萤光读数，或用作测定其它萤光性物质的参比标准物质。）

美拉德反应产物抗氧化性的测定,主要根据实际需要选择不同的测定方法。如选择DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）的清除率来表征美拉德反应产物的抗氧化性（DPPH法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类物质好和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析）。用硫氰酸铁法则是主要用于油脂类的测定,由于油脂被氧化后其氧化物可将Fe2+氧化为Fe3+,后者可与SCN-形成血红色的硫氰酸铁,故可根据此性质测定其抗氧化性。

空心为葡萄糖体系，实心为乳糖体系，○为糖，□为赖氨酸，◇为甘氨酸，△为丙氨酸。

得出结论：美拉德反应中荧光性的变化比褐变更能衡量抗氧化性的变化。

3.3 观点三

Soottawat Benjakul也研究了猪血浆蛋白（porcine plasma protein, PPP)和乳糖、半乳糖以及果糖体系中美拉德反应中294 nm 处的吸光值变化同抗氧化性的关系，得出美拉德反应的抗氧化能力能力与无色中间产物量(294 nm )有很好的线性关系。(此处荧光强度是930 型荧光光度计在激发波长360 nm 、发射波长420 nm 测量荧光强度。）荧光光度计原理是由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。

沈军卫等研究了还原糖(木糖和葡萄糖)和氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)的模式美拉德反应中294 nm 处的吸光值变化同抗氧化性的关系，得出的结论也支持了Soottawat Benjakul的观点。(此处荧光强度是930 型荧光光度计在激发波长360 nm 、发射波长420 nm 测量荧光强度。）