人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯

化

作者：余厚友宋祖军袁顺书刘彦仿杨守京

【关键词】肝肿瘤

关键词: 肝肿瘤;细胞株;热休克蛋白72;克隆;基因表达

摘要:目的克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能. 方法从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中，用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化，经SDS-PAGE 电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot 鉴定. 结果克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQE-30HSP72载体在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的Mr 为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白. 结论克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.

Keywords:liver neoplasms;cell line;heat shock protein72;cloning;gene expression

Abstract:AIM To clone human heat shock protein72（HSP72）gene，do prokaryotic expression and purify HSP72protein for further

study.METHODS Human HSP72gene was obtained by RT-PCR from heat shocked human hepato-carcinoma cell line SMMC-7721.Its product was recombined in vitro with prokaryotic expression vector pQE-30and was transformed to E.coli strain JM109.The proteins，expressed in E.coli strain with HSP72recombinant plasmid under IPTG induction，was obtained by FPLC and Sephacryl S200chro-matography and characterized by SDS-PAGE and Western-blot-confirmed with anti-HSP72McAb.RESULTS The HSP72gene was cloned and identified to be consistent with relevant reports.The HSP72with a molecular weight of72000was highly expressed in pQE-30HSP72.Western blot proved that the expressed product had the antigenicity of HSP72.CONCLUSION The establishment of a series of methods for the cloning，expression and purification of HSP72gene will assist in the structural and functional char-acterization of HSP72.

0 引言

热休克蛋白（HSP）是生物体（或离体的培养细胞）在不良环境因素作用下（如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等）所产生的一组特殊蛋白质，对细胞损伤有保护作用.其生物学功能很广泛，在细胞生长、发育、分化过程中参与基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持并发挥重要作用，属分子伴侣蛋白［1］ .热休克蛋白72（HSP72）是HSP中最保守和最主要的一类.近年来发现很多疾病的发生、发展均与其有关，有必要进一步了解其生物学功能.我们克隆了人HSP72基因，并在大肠杆菌内对该基因进行了诱导表达，建立了一套完备的纯化方法，为进一步研究提供了条件.

1 材料和方法

1.1 材料人肝癌细胞株SMMC-7721和受体菌JM109由本室保存.测序质粒载体pUC19和原核表达质粒pQE-30由中山医科大学叶苓博士惠赠.EcoR I，Pst I，T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自NSBC Sangon公司.DNA Marker、蛋白质相对分子质量标准和anti-HSP72单抗购自Gibco公司.IPTG、细胞总RNA提取试剂盒和质粒提取纯化试剂盒为Promega公司产品.cDNA第一链合成试剂盒购于华美生物公司.

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计根据GeneBank中已报道的人HSP72基因序列，设计了一对PCR扩增引物，并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因内部没有的新的酶切位点EcoR I和Pst I以便于基因的酶切和定向克隆.P1:5

’cggattcATGGCCAAAGC-CGCGGCG3’;P2:5’cgctcgagATCTACCTCCT-CAATGGT3’.

1.2.2 人HSP72基因的扩增人肝癌细胞株SMMC-7721经42℃热休克2h，于休克后16h［2］根据试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链，以其为模板PCR扩增HSP72目的片段.反应条件:去离子水37μL，cDNA1μL，引物各1μL，10×buffer5μL，25mmol・L-1 dNTP1μL，10mmol・L-1 MgCl2 3μL，混匀，94℃变性5min，冰浴1min后，加入Taq DNA聚合酶1μL.PCR 仪扩增，反应参数:先95℃预变性5min，然后按94℃1min，55℃1min，72℃2min的条件进行35个循环，最后72℃延伸10min.

1.2.3 HSP72基因的克隆与测序经PCR扩增后，扩增产物在10g・L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定.将质粒pUC19和目的片段经EcoR I和Pst I双酶切，回收载体和目的片段，在T4DNA连接酶作用下12℃过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后行全基因的全自动序列分析.

1.2.4 HSP72基因的原核表达从经测序鉴定后的pUC19-HSP72中EcoR I和Pst I双酶切回收HSP72目的基因片段，并与经同样限制酶双酶切的原核表达质粒pQE-30相连接，建立原核表达载体pQE-30HSP72，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒