实验一：叶绿体的提取和荧光观察

叶绿体的提取和荧光观察

一、实验目的：

1. 学习分离制备叶绿体的方法，了解制备细胞器的一般程序，观察光镜下叶绿体的形态。

2. 学习和掌握离心机的原理和基本使用方法。

3. 学习荧光显微镜的使用方法及其应用。

二、实验原理及分析：

细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同介质和不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。在等渗溶液中进行组织匀浆、分离，叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行。

荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。

三、实验材料：菠菜叶片

四、实验步骤：

1. 菠菜叶片洗净吸干。称取20克，剪成小块；加入40ml完全介质，在研钵中充分研磨。

2.浆状物用双层纱布过滤；

3. 汁液置于离心管中，1100 rpm(200g)离心5Min；

4. 弃去沉淀，取上清液1900 rpm(600g)离心12Min；

5. 弃去上清液，沉淀加入15ml A液，轻轻吹打悬浮；

6. 悬浮液600g离心12Min；

7. 弃去上清液，取沉淀，悬浮于A液中；

8.普通光学显微镜下观察；

9. 荧光显微镜下观察

1〕荧光镜下紫外直接观察；

2〕滴加吖啶橙后观察

五、实验结果及分析：

在普通显微镜下，叶绿体呈现出绿色椭球形，为正常结构。可能因为差速离心得到的样品不纯，还观察到一些组织碎片。

在荧光显微镜下观察未染色的样品，可以看到叶绿体经激发光波照射后，自发荧光呈现出火红色，呈点状分布。由于样品稀释倍数略高，故叶绿体的密度较低。悬液其他组分在该激发光波下无自发荧光反应，故背景呈黑色，能观察到叶绿体的火红色荧光效果。

在荧光显微镜下观察吖啶橙染色的样品，可以看到一部分呈现出橘红色荧光，一部分呈现出绿色。橘红色是叶绿体的诱发荧光，绿色的是悬液中混有的细胞核碎片中的DNA和RNA，经吖啶橙染色后呈现出绿色。由于悬液稀释倍数略高且叶绿体不纯，观察到的橘红色较少，绿色较多。