细菌的分离与鉴定详解
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1.平板划线法
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌 种逐步稀释分散到培养基的表面。
2.稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂 布到琼脂固体培养基的表面进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细 胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
1、利用选择培养基进行直接分离
选择培养基
只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其 他微生物生长的培养基
选择培养基
可抑制细菌、放线 菌细胞壁主要成分
肽聚糖的合成
其细胞壁是由纤 维素、几丁质、
葡聚糖组成
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌
脲酶
CO(NH2)2 +H2O
NH3 + CO2
原理：培养基的氮源为尿素，只有能
合成脲酶的微生物才能分解尿素，以 尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由
于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长 发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养 基就能够选择出分解尿素的微生物。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O
➢不能区分死菌与活菌； ➢不适于对运动细菌的计数
计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个
槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半， 其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格， 中央的一大格作为计数用，称为计数室。
血球计数板计数室有两种刻度
*
*#
#
#
*
*
1大格=16中格 25×16=400小格
血球计数板的使用
以计数酵母菌为例
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小 方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可. (3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加 盖专用的厚玻片. (4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻 片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取, 捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按 对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个 小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板, 除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格 (即80个小方格)的酵母菌数. (6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方 格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左 方线上的酵母细胞). (7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计 算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.
3、平板划线法（streak plate method）
分区划线法（蛇形线法）操作图
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
分区划线法适用范围： 适用于浓度较大的样品
连续划线法操作图
连续划线法适用范围： 适用于浓度较小的样品
二、选择培养分离
原理
• 创造适于目的微生物生长条件 • 促使目的微生物快速生长呈优势菌 • 抑制非目的微生物生长 • 从混杂微生物中分离目的微生物
微生物纯种分离
• 将多种混杂微生物，经某种技术或方法 分离成纯种的过程
纯培养（pure culture）
• 在适宜条件下培养纯种获得的培养物 （群体）
菌落
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内 部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可 见的、有一定形态结构的子细胞群体，称 为菌落(colony)。
一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 单个微生物只在固体培养基上形成菌落； 在液体培养基中不会形成菌落
稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平 板操作。
（二）、纯种平板分离的不同方法
104/ml
103/ml
102/ml
101/ml
从土壤中分离纯微生物
1、涂布平板法（spread plate method)
涂布平板法 Leabharlann Baidu释倒平板法
2、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)
#
#
1大格=25中格 16 ×25 =400小格
3.计算公式
(1)16格×25格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数
(2)25格x16格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、 光泽、质地、颜色和透明程度等。每一种 细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。 不同种或同种在不同的培养条件下，菌落 特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴 定有一定意义。
（一）、微生物纯种分离的原理和方法
微生物样品
第二节 分离特定的微生物并测定 其数量
• 用固体培养基分离、培养
微
• 用液体培养基分离、培养
生 物
• 单孢子分离
分
• 选择培养分离
离 方
• 二元培养物分离、培养
法
要分离微生物，必须根据它的特点，包括营养、生 理、生长条件等，采用选择培养的方法，经过一定 时间的培养后，使这种微生物在群落中的数量不断 增加，在通过平板稀释法等进行纯培养分离
分散成单个微生物
某种方法
培养
单菌落
多种混杂
平板
每个菌落为纯种（纯培养）
单菌落转接培养
纯种（纯培养）
一、用固体培养基（营养琼脂平板） 分离纯种
平板分离法：将单个微生物分离和固定在固 体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物 体经过生长、繁殖均可形成单个菌落
纯化细菌
微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。
葡萄糖
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属
于哪类培养基？
固体培养基 选择培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
1、显微镜直接计数：利用血
球计数板，在显微镜下计算一定容积里样 品中微生物的数量
缺点
不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物
加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才 能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌 种逐步稀释分散到培养基的表面。
2.稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂 布到琼脂固体培养基的表面进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细 胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
1、利用选择培养基进行直接分离
选择培养基
只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其 他微生物生长的培养基
选择培养基
可抑制细菌、放线 菌细胞壁主要成分
肽聚糖的合成
其细胞壁是由纤 维素、几丁质、
葡聚糖组成
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌
脲酶
CO(NH2)2 +H2O
NH3 + CO2
原理：培养基的氮源为尿素，只有能
合成脲酶的微生物才能分解尿素，以 尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由
于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长 发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养 基就能够选择出分解尿素的微生物。
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
KH2PO4 NaH2PO4 MgSO4`7H2O
➢不能区分死菌与活菌； ➢不适于对运动细菌的计数
计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个
槽构成三个平台，中央平台又由一短槽隔成两半， 其上各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大格， 中央的一大格作为计数用，称为计数室。
血球计数板计数室有两种刻度
*
*#
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1大格=16中格 25×16=400小格
血球计数板的使用
以计数酵母菌为例
(1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小 方格内含有4-5个酵母细胞为宜,一般稀释10倍即可. (3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加 盖专用的厚玻片. (4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻 片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取, 捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.
(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按 对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个 小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板, 除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格 (即80个小方格)的酵母菌数. (6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方 格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左 方线上的酵母细胞). (7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计 算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.
3、平板划线法（streak plate method）
分区划线法（蛇形线法）操作图
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
分区划线法适用范围： 适用于浓度较大的样品
连续划线法操作图
连续划线法适用范围： 适用于浓度较小的样品
二、选择培养分离
原理
• 创造适于目的微生物生长条件 • 促使目的微生物快速生长呈优势菌 • 抑制非目的微生物生长 • 从混杂微生物中分离目的微生物
微生物纯种分离
• 将多种混杂微生物，经某种技术或方法 分离成纯种的过程
纯培养（pure culture）
• 在适宜条件下培养纯种获得的培养物 （群体）
菌落
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内 部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可 见的、有一定形态结构的子细胞群体，称 为菌落(colony)。
一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养； 单个微生物只在固体培养基上形成菌落； 在液体培养基中不会形成菌落
稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平 板操作。
（二）、纯种平板分离的不同方法
104/ml
103/ml
102/ml
101/ml
从土壤中分离纯微生物
1、涂布平板法（spread plate method)
涂布平板法 Leabharlann Baidu释倒平板法
2、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method)
#
#
1大格=25中格 16 ×25 =400小格
3.计算公式
(1)16格×25格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 100小格内酵母细胞个数/100×400×104×稀释倍数
(2)25格x16格的血球计数板计算公式: 酵母细胞数/ml= 80小格内酵母细胞个数/80×400×104×稀释倍数
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、 光泽、质地、颜色和透明程度等。每一种 细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。 不同种或同种在不同的培养条件下，菌落 特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴 定有一定意义。
（一）、微生物纯种分离的原理和方法
微生物样品
第二节 分离特定的微生物并测定 其数量
• 用固体培养基分离、培养
微
• 用液体培养基分离、培养
生 物
• 单孢子分离
分
• 选择培养分离
离 方
• 二元培养物分离、培养
法
要分离微生物，必须根据它的特点，包括营养、生 理、生长条件等，采用选择培养的方法，经过一定 时间的培养后，使这种微生物在群落中的数量不断 增加，在通过平板稀释法等进行纯培养分离
分散成单个微生物
某种方法
培养
单菌落
多种混杂
平板
每个菌落为纯种（纯培养）
单菌落转接培养
纯种（纯培养）
一、用固体培养基（营养琼脂平板） 分离纯种
平板分离法：将单个微生物分离和固定在固 体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物 体经过生长、繁殖均可形成单个菌落
纯化细菌
微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。
葡萄糖
1.4g 2.1g 0.2g 10.0g
尿素
1.0g
琼脂
15.0g
①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属
于哪类培养基？
固体培养基 选择培养基
②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素
1、显微镜直接计数：利用血
球计数板，在显微镜下计算一定容积里样 品中微生物的数量
缺点
不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物
加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农 作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才 能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶