垂直式蛋白质电泳的操作步骤

实验试剂和器材

1.材料：低分子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白：兔磷酸化酶B

MW=97,400 牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌动蛋白MW=43,000 牛碳酸酐酶

MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂MW=20,100

鸡蛋清溶菌酶MW=14,400 开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。

2.实验试剂

(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）

（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L 盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定容至100ml。

（7）10%过硫酸铵(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。

（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。

（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

实验过程

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶.

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘

5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去

底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

6、加样三个。（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。

（2）取10µl样品1溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl 和10µl。7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散.※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.

以上是我实验课件，希望有所帮助！

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