仪器分析-高效液相色谱(HPLC)-华中农业大学课件
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高效液相色谱仪ppt课件
8
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
9
根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
11
图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
30
2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
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根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
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图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
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2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
《仪器分析》教案课件PPT-第5章 高效液相色谱法PPT文档
四、尺寸排阻色谱法（SEC） （sizeexclusionchromatography）
2017-动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定 相上的吸附能力不同而加以分离。
吸附剂
溶质 溶剂
2017-6-620
吸附剂
二、液液分配色谱法（LLC）
流动相和固定相都是液体。 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
第五章高效液相色谱法
HighPerformanceLiquidChromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体
2017-6-62
第一节高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法（HPLC） 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色 谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离 柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分
尺寸排阻色谱法的分离机制：体积排阻效应
样品分子 凝胶珠
流动相
溶质在两相间不 是靠其相互作用 力的不同来进行
分离； 而是按照分子大 小进行分离的； 大分子物质先洗 脱出来，小分子
2017-6-626物质后洗脱出来
孔道
凝胶珠内具有一定大小的孔穴， 体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出 来； 中等体积的分子部分渗透；
2017-6-611
2017-6-612
2017-6-613
六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中 （Load）
进样后 （Inject）
4.色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径 4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不 锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为 7000～10000理论塔板数/m。
2017-动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定 相上的吸附能力不同而加以分离。
吸附剂
溶质 溶剂
2017-6-620
吸附剂
二、液液分配色谱法（LLC）
流动相和固定相都是液体。 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
第五章高效液相色谱法
HighPerformanceLiquidChromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体
2017-6-62
第一节高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法（HPLC） 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色 谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离 柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分
尺寸排阻色谱法的分离机制：体积排阻效应
样品分子 凝胶珠
流动相
溶质在两相间不 是靠其相互作用 力的不同来进行
分离； 而是按照分子大 小进行分离的； 大分子物质先洗 脱出来，小分子
2017-6-626物质后洗脱出来
孔道
凝胶珠内具有一定大小的孔穴， 体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出 来； 中等体积的分子部分渗透；
2017-6-611
2017-6-612
2017-6-613
六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中 （Load）
进样后 （Inject）
4.色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径 4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不 锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为 7000～10000理论塔板数/m。
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
高效液相色谱技术(hplc)PPT教学课件(1)
• 按键合到基质上的官能团可分为：
• ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、
• C8、C4等。
• ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 • ⑶离子交换键合相：
• 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 • 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 • ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离
溶质在固定相中的量 溶质在流动相中的量
• “ k’ ”是比“ab tR”还常用的保留值，它与柱子
的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动
相
的
分
配
性
质
、
柱
温以及 k ,＝ tR－t0 t0
相
空
间
比
（
即
固
定
相
和流动相之体企积比）有关。“ k’ ”又定义为
在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消
除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是
( B奌： u＝2 mm/sec )
2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec
1 mm 50 μL/min 1 mm/sec
由 “1 mm/sec ” 最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。
由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一 个月才用一并。
• 5. 保留值方程：
改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次
对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 – NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。
• 分辨率：
RS＝
2(tR2－tR1 tW1＋tW 2
)
tR(1)
• ⑴反相柱：填料为非极性，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、
• C8、C4等。
• ⑵正相柱：填料为极性，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 • ⑶离子交换键合相：
• 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 • 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 • ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离
溶质在固定相中的量 溶质在流动相中的量
• “ k’ ”是比“ab tR”还常用的保留值，它与柱子
的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动
相
的
分
配
性
质
、
柱
温以及 k ,＝ tR－t0 t0
相
空
间
比
（
即
固
定
相
和流动相之体企积比）有关。“ k’ ”又定义为
在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消
除了保留值的波动因素，而平衡常数“ K ”是
( B奌： u＝2 mm/sec )
2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec
1 mm 50 μL/min 1 mm/sec
由 “1 mm/sec ” 最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。
由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一 个月才用一并。
• 5. 保留值方程：
改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次
对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 – NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。
• 分辨率：
RS＝
2(tR2－tR1 tW1＋tW 2
)
tR(1)
高效液相色谱法—高效液相色谱仪(仪器分析课件)
• 间断改变流动相的组成，以调节它的极性，使每个流出的组分都有合适的容量 因子，并使样品中的所有组分可在最短的分析时间内，以适用的分离度获得圆 满的选择性分离。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
• 内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入梯度混 合室，混合后进入色谱柱。
• 外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混合。
柱子内径一般为1～6 mm。常用的标准柱型是内径为4.6或 3.9 mm ，长度为15～30 cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度5 ～10 μm ，柱效以理论塔板数计大约 7000～10000。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
（三）检测器 1. 紫外吸收检测器 紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛的检测器。 2. 光电二极管阵列检测器（PDAD） 3. 示差折光检测器（DRD） 4. 电导检测器 5. 荧光检测器 6. 蒸发激光散射检测器
HPLC
HPLC
高效液相色谱仪 一、高效液相色谱仪工作流程及组成
• 1.高效液相色谱仪的工作流程图
一、高效液相色谱仪工作流程及组成 流 动 相
高压泵
2.高效液相色谱仪组成
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
检测器
二、仪器操作 （一）开机前 的准备
• 在开机前应详细阅读 仪器使用说明书，了 解仪器的参数、熟悉 仪器操作规程。
高压输液泵
3.. 梯度洗脱装置
高压梯度： 用于二元梯 度，用两个泵分别按设定 的比例输送A和B两溶液 至混合器
（二）进样装置 常见的 进样装置有： 1.隔膜进样 2.停留进样 3.六通进样 4.自动进样
（三）色谱分离系统
色谱柱是色谱仪最重要的部件（心脏）。通常用后壁玻璃 管或内壁抛光的不锈钢管制作的，对于一些有腐蚀性的样 品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟乙烯管。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
仪器分析高效液相色谱PPT课件
这种固载化的配基将只能和具有 亲和力特性吸附的生物大分子相互 作用而被保留，没有这种作用的分 子不被保留。
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2020/4/22
15
6.1.6 离子交换色谱法
离子交换色谱法
固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，
在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基
阳离子交换树脂
在表面未端芳环上接上季胺基
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
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2020/4/22
6
6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
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2020/4/22
13
分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离
的一种色谱方法。 ➢ 以凝胶 (gel) 为固定相，它类似于分子筛， 但凝胶的孔径比分子筛要大得多。
➢ 凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量 的化合物可以进入孔中，滞留时间长；中等 体积的分子部分渗透；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。
荧光检测器——10-11g。
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6.1.6 离子交换色谱法
离子交换色谱法
固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，
在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基
阳离子交换树脂
在表面未端芳环上接上季胺基
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
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6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
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分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离
的一种色谱方法。 ➢ 以凝胶 (gel) 为固定相，它类似于分子筛， 但凝胶的孔径比分子筛要大得多。
➢ 凝胶内具有一定大小的孔穴，小分子量 的化合物可以进入孔中，滞留时间长；中等 体积的分子部分渗透；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。
荧光检测器——10-11g。
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
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Leaf in mineral ether
Mineral ether (Mobile phase)
Chlorophyll ａ Chlorophyll ｂ
Carotenol Provitamin A
Column
Calcium carbonate （Stationery phase） Chromatogram
eg. UV-detector
DL 10-9g
Fluorescence- detector DL 10-11g
D. High Automatic Degree with Computer ( Chemi-station)
Summarize:
“Four High”—High pressure
High velocity High efficiency High sensitivity
Chapter Eleven
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
Chromatography
Section One Introduction
Developing History of HPLC The Difference Between HPLC and Classical LC The Comparison Between HPLC and GC
Conclusion：
Both HPLC and GC have their own superiorities. They are mutually complementary in the separation and analysis area .
Section Two The classification of HPLC
The Comparison Between HPLC
and GC
➢ Similarity A. The basic chromatography principle is
similar. a. Plate theory b. Rate theory
B. The principle of qualitative analysis and quantitative analysis is similar. TR ; A
Developing History of HPLC
HPLC was developed raidly in 1970’s. Based on the foundation of classical LC. Meanwhile, adopting the theory of GC. The earliest LC was found in 1906 by Michael Tswett.
C. Both with computer to improve automatic degree .
➢ Difference A. Mobile phase is different. (Acetonitrile,
methyl cyanide) B. Stationary phase is different. C. The applying range of HPLC is wide. D. Instrument is different.
Procedure： Elution Method： Chromatography
The Difference Between HPLC and Classical LC
A. Employing high pressure pump to apply high pressure ( in the range of 150~350x105 Pa)
a. To reduce the resistance of liquid in column.
b. To mprove the transmission and analysis
velocity.
B. Employing new stationary phase-chemially bonded stationary phase
a. To improve the separation efficiency eg. N=30000/m
C. Employing Detectors with High Sensitivity Ultraviolet photometric detector; Fluorescence detector; Differential refractive index detector; Electrical conductivity detector
Liquid- Liquid Chromatography Liquid- Solid Chromatography Ion Exchange Chromatography Gel Chromatography
Liquid- Liquid Chromatography
Liquid- Solid Chromatography