饲料蛋白水解氨基酸含量的测定-实验方案

四、实验条件
2
1.仪器： (1) 样品粉碎机 (2) 样品筛（60 目） (3) 分析天平（感重 0.0001 g） (4) 真空泵 (5) 过滤器 (6) 恒温干燥箱 (7) 漩涡混匀仪 (8) 磁力搅拌器 (9) 酒精喷灯 (10)蒸空冷冻干燥仪 (11)纯水系统 (12)注射器 (13)0.22 μm 微孔滤膜 (14)100/1000 μL 移液枪 (15)试管（20*200）、烧杯、量筒、容量瓶、漏斗、氨基酸样品瓶等玻璃器具 (16)日立 L-8900 全自动氨基酸分析仪：配有自动进样器，2622#色谱柱，可见分光光度计， 柱温箱配有电子加热/制冷温控装置，EZChrom Elite 分析软件。 2.试剂： （1）酸解剂——盐酸溶液，c(HCl)=6 mol/L：盐酸(GR)与纯水 1:1 混合，每升盐酸溶液 含 5 g 苯酚。 （2）样品稀释溶液/空白溶液——盐酸(GR)溶液，c(HCl)=0.02 mol/L （3）17 种氨基酸混合标准储备液，各组分浓度 c(氨基酸)=2.50 μmol/mL, （4）混合氨基酸标准工作液：取 40 μL 氨基酸标准储备液用样品稀释溶液稀释至 1 mL， 使各氨基酸组分浓度 c(氨基酸)=100 nmol/mL。 （5）液氮、氮气 （6）燃烧用酒精 （7）超纯水 （8）不同 pH 和离子强度的洗脱用柠檬酸钠缓冲液（按仪器说明书配制）
中蛋白质水解后氨基酸的含量。
蛋白质水解法适于含动植物蛋白的单一饲料、配合饲料、浓缩饲料和预混料中氨基酸
的测定，包含常规酸水解法、氧化酸水解法和碱水解法。氧化酸水解法主要用于测定含硫
氨基酸，碱水解法只适于测定色氨酸。普通酸水解法会破坏色氨酸和部分破坏含硫氨基酸，
适于测定除色氨酸、含硫氨基酸(胱氨酸和蛋氨酸等)以外的蛋白水解氨基酸，使用最广，
饲料中蛋白质水解氨基酸含量的测定
一、实验目的
1. 掌握饲料中蛋白水解氨基酸的测定法及原理。
2. 掌握饲料中蛋白质水解氨基酸的样品制备方法。
3. 了解全自动氨基酸测定仪的分析原理及工作流程。
4. 了解氨基酸测定结果的影响因素。
二、实验内容
采用全自动氨基酸分析仪应用茚三酮显色法测定饲料样品（豆粕、玉米、配合饲料）
泵压。泵压正常方可进行后续测定。
（5）清洗泵和自动进样器，打开分离柱柱温箱（50 °C），反应柱温箱（135 °C）和 W 灯。
（6）编辑并保存样品分析方法，主要为色谱梯度洗脱程度（说明书方法，可根据实际情
况修改）。
（7）编辑并保存序列表，包含 RG 清洗再生程序、标准品、空白和样品分析序列（样品瓶
约 700 ml
PH-5 B5
约 700 ml
6.19 g 6ml 1M NaOH 5.66 g 19.80 g 135.0 ml
0.1 ml
7.74 g -
7.07 g 22.00 g 25.0 ml
0.1 ml
13.31 g -
3.74 g 12.80 g 9.00 ml
0.1 ml
26.67 g
54.35 g 6.10 g
5 ml 0.1 ml
-
50 ml -
4 ml
4 ml
4 ml
4 ml
-
1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml 1000 ml
PH-RG B6
约 700 ml
-
8.00 g -
100.0 ml -
0.1 ml 4 ml
1000 ml
pH
3.3
3.2
表 1.PH 型色谱柱分离 17 种氨基酸出峰顺序
缩写 支链 等电点
R基
分子量
1
天冬氨酸 Asp 酸性 苏氨酸 Thr 亲水性 丝氨酸 Ser 亲水性 谷氨酸 Glu 酸性 脯氨酸 Pro 疏水性 甘氨酸 Gly 亲水性 丙氨酸 Ala 疏水性 半胱氨酸 Cys 亲水性 缬氨酸 Val 疏水性 甲硫氨酸 Met 疏水性 异亮氨酸 Ile 疏水性 亮氨酸 Leu 疏水性 酪氨酸 Tyr 疏水性 苯丙氨酸 Phe 疏水性 赖氨酸 Lys 碱性
样品、氧化水解样品等）。
7
本实验将采用该样品预处理方法。
三、实验原理
蛋白质由氨基酸聚合而成，其中氨基酸的测定需先水解成单一氨基酸。由于多数氨基
酸不含特征发色基团（除 Tyr、Try、Phe 含苯环有紫外吸收），氨基酸的分析依赖于衍生
化反应。混合氨基酸经过离子交换树脂分离，依次发生显色反应后，由分光光度计测定吸
光度，采用外标法定量。
3
表 2.PH 缓冲溶液
名称
超纯水 柠檬酸钠 (2H2O)(GR) 氢氧化钠(GR)
氯化钠(GR) 柠檬酸(H2O)(GR)
乙醇(HPLC P) 苯甲醇 辛酸
聚氧乙烯十二烷基 醚 Brij-35* 水定容至
PH-1 B1
约 700 ml
PH-2 B2
约 700 ml
PH-3 B3
约 700 ml
PH-4 B4
表 4.梯度洗脱程序
5
（5）样品采集时间 30 min。
2. 仪器操作步骤
（1）打开电脑、主机及工作站，联机，仪器初始化。
（2）在主机气体阀 Open 的状态下更换上机缓冲溶液与茚三酮反应液。
（3）打开氮气阀，反应液鼓泡 30 min。打开泵 1/2 阀 Purge，排管路中的气泡。
（4）设置泵 1 为 B1 100%（0.1 mL/min），泵 2 为 R3 100%（0.1 mL/min）并开泵，记录
4.0
4.9
-
-
备注：1.表面活性剂 Brij‐35*制备：取 25 g 聚氧乙烯十二烷基醚固体粉末溶于 100 ml 纯 水。
2. B1-B6 使用高质量 0.22 μm 水相滤膜过滤。 3．如溶液加入苯甲醇后出现乳白色浑浊，超声促进苯甲醇溶解，直至溶液澄清。
(9)茚三酮溶液（按仪器说明书配制）
表 3.茚三酮试剂
精氨酸 Arg 碱性 10.76
174.2
2. 氨基酸检测原理：游离 α-氨基和 α-羧基的氨基酸与茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物 二酮茚－二酮茚胺，用分光光度计在 570 nm 下测其含量,产物的颜色深浅与氨基酸含量成 正比。氨基酸与羟脯氨酸反应不释放 NH3，直接生成黄色化合物，吸收波长在 440 nm。
1. 氨基酸分离原理：氨基酸的洗脱顺序主要取决于各氨基酸的等电点（酸性氨基酸 pI
2.8-3.2，中性氨基酸 pI 5.0-6.3，碱性氨基酸 pI 7.6-10.8）。所有氨基酸在 pH 2.2
以下都带正电荷，被带负电的阳离子树脂吸附，但吸附程度不同：碱性氨基酸结合力最强，
其次为芳香氨基酸和中性氨基酸，酸性氨基酸结合力最弱。当洗脱液的 pH 值逐渐升高时，
位置、样品编号、进样量、分析方法、样品保存路径）
（8）运行序列表
（9）在 Off-line 模式下进行数据处理。
（10）所有样品测定结束后，断开联接，依次关闭程序、电脑和主机，仪器管路及溶液用
氮气保护。
六、结果与计算
1． 数据记录
样品编号
称量质量
定容体积
稀释倍数
6
2． 结果计算
七、任务分工 1. 学生分组进行样品制备，每组 3 种饲料（玉米、豆粕和 1 种配合饲料）。 2. 各组协作配制氨基酸标准品、空白溶液、酸解剂、氨基酸上机溶液共 12 种。 3. 演示上机测定及数据处理。 4. 测试结束后各组进行数据统计及分析，完成实验报告。 八、思考与讨论 1. 结合结果计算公式，讨论样品前处理过程中，可能影响数据准确性的因素。 2. 结合所学专业或兴趣，查阅资料，制定一个科学合理的样品预处理方案（可以是游离
原来带正电荷的酸性氨基酸先失去正电荷从树脂洗脱下来，此时中性氨基酸和碱性氨基酸
仍与树脂结合的紧，需要更高的 PH 值洗脱液才能将它们洗脱下来。另外，洗脱顺序还与
分子极性和分子大小有关，具有短侧链的氨基酸比长侧链的氨基酸先洗脱下来，支链增加
洗脱越容易，侧链羟基化氨基酸优先洗脱下来。综合如下表 1：
名称
容器显示 步骤
试剂
1
R1
2
茚三酮
3
4
乙二醇甲醚(AR，国药集团) 茚三酮(特级)
硼氢化钠(优级纯) 继续上机 N2 鼓泡 30min
计量
979 ml 39 g 81-85 mg
1
2
R2
3
茚三酮缓冲液 4
5
6
无水醋酸钠(GR) 乙二醇甲醚(AR)
冰醋酸(GR) 超纯水
乙二醇甲醚定容至 上机 N2 鼓泡 30min
117.15
5.74
-(CH₂)-S-CH₃ 149.21
6.05 -CH(CH₃)-CH₂-CH₃ 131.17
6.01 -CH₂-CH(CH₃)₂ 131.17
5.64 -CH₂-C₆H₄-OH 181.19
5.49
-CH₂-C₆H₅
165.19
9.6
-(CH₂)₄-NH₂ 146.19
7.6
155.16
141.78 g 401 ml 123 ml 336 ml 1000 ml
4
1
R3
2
乙醇(色谱纯) 超纯水定容
50 ml 1000 ml
备注：1. 抽滤时，使用 0.22μm 滤膜，R1-R2 有机相、R3 无机相。有机相（R1/R2）抽 滤时滤器涂抹凡士林，且要先用乙二醇甲醚透膜再过滤。 2. R1 不定容，需现用现配，避光、避免空气氧化。 3. 配制 R2 时醋酸钠不易溶解，可微热至约 60 度，促进溶解。 五、实验步骤 （一）样品前处理 1. 样品粉碎、绝干：四分法取样，选取代表性的样品 10-20 g,粉碎后 60 目过筛、混匀， 于干燥箱中 105 °C 恒重，至质量差不超过 0.0002 g，保存至干燥器内备用。 2. 称样：用酒精喷灯烧结试管 1/3 处拉细呈颈状，称样 100-200 mg,置于试管底部。 3. 水解：分批加入 15 mL 酸解剂充分浸润样品。充氮气约 1 min 除氧气，烧结密封试管。 将水解管放在(110 士 1)°C 恒温干燥箱中，水解 22-24 h。 4. 稀释、过滤：水解管冷却至室温后开管，将溶液转移至 50/100 mL 容量瓶中，超纯水 定容，混匀静置，取上清用 0.22 μm 微孔滤膜过滤至 EP 管中作为储备液。用移液枪定量 取 400 μL 至样品瓶。 5. 脱酸、稀释：样品液用液氮迅速固化后用冻干机蒸空干燥至瓶内完全无液体，加入 800 μL 0.02 N HCl 溶液，涡旋混匀，放至 4 °C 备用。 （二）上机测定 1. 色谱条件 （1）色谱柱：PH 型（钠型）：内径 4.6 mm* 长 60 mm，填料为阳离子交换树脂（强酸型 磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）担体粒径 3 µm。 （2）进样量 20 μL。 （3）检测波长：570 nm 和 440 nm。 （4）梯度洗脱程序
组氨酸 His 碱性
2.85
-CH₂-COOH
133.1
5.6
-CH(CH₃)-OH 119.12
5.68
-CH₂-OH
105.09
3.15 -(CH₂)₂-COOH 147.13
6.3
-C₃H₆
115.13
6.06
-H
75.07
6.11
-CH₃
89.09
5.05
-CH₂-SH
121.16
6
-CH-(CH₃)₂