蓝白斑筛选法

【实验步骤】 1、平板的准备
在40uL X-gal中加入4uL IPTG，充分混合，在无菌条件下涂 布于含Amp(浓度为50ug/mL)的LB平板上，将平板置于37℃恒温 箱中2~3hr，以使培养基充分吸收色素底物X-gal； 2、涂板
将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-gal、IPTG的平 板上，正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板， 37℃培养12~18hr； 3、观察实验结果
实验十五 重组子的筛选技术 －－蓝白斑筛选法
【实验目的】
学习蓝白斑法筛选重组菌落的原理及具体的实验操作过程。
【实验材料】
移液器及吸咀 培养皿 接种环 1.5mL离心管 恒温培养箱
水浴锅
LB液体培养基
蛋白胨
8g
氯化钠
7g
酵母
5g
定容至1000mL，用NaOH调pH至7.5~7.6，可置-20℃保存，
高压灭菌
LB固体培养基 液体培养基中加入1.5%的琼脂，15磅30分钟高压灭菌后使用
X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖) X-gal溶于N, N’-二甲基甲酰胺中配20mg/mL原夜，-20℃避光
保存 IPTG(异丙基--D-半乳糖苷)
0.2g/mL分装，贮存于-20℃ 氨苄青霉素(Ampicillin)
【实验原理】
由于克隆用载体pGEM-T Easy Vector带有lacZ的调节序列和 β-半乳糖苷酶的部分编码序列，可以与缺陷型宿主DH 5α在诱 导物IPTG存在下，形成α-互补，宿主菌在含色素底物X-gal的 培养基平板上形成蓝斑；在有外源DNA片段插入到载体多克隆 位点时，就使载体编码β-半乳糖苷酶的部分序列失活，带有重 组质粒的宿主菌产生白斑。为提高筛选的准确性，实验中采取 蓝白斑筛选法。
蓝白斑筛选重组菌落
液体培养
挑取白 色菌落
连接产物
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涂布
添加有氨苄青霉素、X-gal 和IPTG的固体培养基
37℃培养12~16h
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1g Ampicillin溶于5mL灭菌水中，配成母液，保存于-20℃ 转化菌
【实验原理】 β-半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，最
常用的β-半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子，它们使载体 中带有大肠杆菌lac操纵子的调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末 端146个氨基酸的序列。用异丙基--D-半乳糖苷(IPTG)可诱导 这个末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的β-半乳糖苷 酶缺陷型进行互补，恢复该酶的活性，这一过程称为α-互补。
X-gal和IPTG的作用
IPTG可诱导缺陷型大肠杆菌DH 5α表达出半乳糖苷酶，该酶 可分解添加于培养基中无色的X-gal成半乳糖和深蓝色的底物5溴-4-氯-靛蓝，使菌落呈现出蓝色反应；在T质粒载体lacZα 序列中，含有一系列不同限制酶的单一识别位点，其中任何一 个位点插入了外源克隆DNA片段，都会阻断半乳糖苷酶的读码 结构，使其编码的α肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因 此，根据这种半乳糖苷酶的显色反应，便可检测出含有外源D NA插入序列的重组克隆。