单克隆抗体的标记
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体（一）杂交瘤细胞1．亲本细胞（1）骨髓瘤细胞SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。
应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。
（2）免疫亲代细胞经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。
应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。
适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。
2．细胞融合与克隆化采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。
3．杂交瘤细胞检定（1）抗体分泌稳定性连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。
（2）细胞核学特征检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。
4．鼠源病毒检查按附录要求检测鼠源病毒。
5．支原体检查按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
6．无菌试验按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
（二）单克隆抗体的检定1．免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。
2．亲和力用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。
一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。
3．特异性测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。
4．交叉反应按附录要求。
免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。
来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。
5．效价测定用适宜方法测定。
（三）其他原材料1．细胞培养用小牛血清支原体检测应为阴性。
经小量试验适于杂交瘤细胞生长。
2．培养液应有培养液来源，质量指标。
3．化学试剂规格应达到分析纯以上。
抗体PE荧光素标记操作流程记录
1.目的
规范单克隆抗体标记荧光PE (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光PE (快速标记法）操作
3.术语和定义
藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm。
4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.
5.1溶液配制
5.2其他试剂
6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与PE反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg PE荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。
淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。
6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。
单克隆抗体
中文名称：单克隆抗体英文名称：monoclonal antibody; McAb; mAb第42天采血和ELISA检测第56天第四次免疫（抗原溶于PBS或盐水）第61天细胞融合细胞融合（一）融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。
聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。
用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。
50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。
也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。
不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。
每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。
要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。
（二）融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。
融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。
3:1或5:1最为常用。
1．试剂与材料(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。
(2)1640培养液100ml。
(3)完全1640液100ml。
(4)2.5%FCS－1640液50ml。
(5)HAT培养液100ml。
(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。
如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。
(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。
(8)40孔塑料培养盘。
2．操作方法⑴准备好脾细胞。
⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。
抗H(单克隆抗体)检查
抗H（单克隆抗体）
1. 试验步骤
1.1在一干净的有标记的试管中滴加1滴（50ul）抗H试剂；
1.2 在该试管中加1滴（50ul）3%左右的红细胞悬液；
1.3 混匀，900-1000g离心15-30秒；
1.4 轻摆重炫细胞沉淀，并检查凝集反应；
1.5 判读并记录结果。
2. 实验结果的解释
2.1 红细胞凝集为阳性结果表示H抗原的存在，不凝集为阴性结果，但并不能证明H抗原不存在。
2.2 用此试验检测的主要意义在于观察反应的不同强度，与质控试验作对照更能说明试验结果。
2.3一般来说人类红细胞上H抗原的强度与A、B抗原相反，通常红细胞上H抗原的强度排列为：O细胞>B细胞>A细胞>AB细胞。
2.3 O细胞与抗H呈强凝集反应，B细胞和抗H反应凝集较弱，一些A1细胞或AB细胞与抗H反应凝集极弱，可能出现阴性反应。
A2细胞一般与抗H呈中等强度凝集，而A2B细胞与抗H反应强度可在较大范围内变化，其他的亚型细胞如：A3、B3、Ax、Bx、Am、Bm等均与抗H 呈较强反应，孟买性细胞因缺少H抗原，因此与抗H反应通常为阴性。
2.4 ABH抗原的发育，可早到37日胎龄大的胎儿，其强度在怀孕期间也并不增加。
新生儿红细胞的ABH反应性，没有成人强，只相当于成人的25%-50%。
除年龄外，ABH抗原表型可因种族、基因交互影响及疾病的状态而异。
3.参考资料
3.1全国临床检验操作规程第3版
3.2 抗H（单克隆抗体）使用说明书。
单克隆抗体检测方法
单克隆抗体检测方法
单克隆抗体检测方法是一种用于检测特定分子的方法。
该方法使用经过精确制备的单克隆抗体（具有一致的抗体亚基和特异的抗原结合位点），可以高度特异地识别和结合目标分子。
单克隆抗体检测方法通常包括以下步骤：
1. 抗原制备：目标分子（抗原）首先被制备和纯化，以便与抗体反应。
2. 抗体制备：针对目标分子，通过免疫动物（如小鼠或兔子）注射抗原，并从动物体内收集免疫细胞。
3. 细胞融合：将免疫细胞与癌细胞融合，形成称为杂交瘤（hybridoma）的细胞群。
4. 克隆筛选：通过稀释法或单细胞悬浮法，将杂交瘤细胞分离并培养成单克隆细胞系。
然后，对每个细胞系进行特异性和亲和性筛选，以选择特异性最好的单克隆抗体。
5. 抗体生产：选定的单克隆抗体细胞系被扩大培养，并收集抗体。
6. 抗体标记：单克隆抗体可用于标记分子。
这可通过化学方法（如生物素标记、
荧光标记等）或生物技术方法（如重组蛋白标记或酶标记）来完成。
7. 抗原检测：标记的单克隆抗体与目标分子反应，形成特异性的结合，然后用适当的方法测量标记物，以确定抗原的存在和浓度。
单克隆抗体检测方法具有高度特异性和灵敏度，并且可用于诊断疾病、检测药物和生物分子等许多应用领域。
单克隆抗体
单克隆抗体技术【原理及意义】单克隆抗体技术(The technique of monoclonal antibody)是由Kǒhler与Milstein于1975年创立的。
他们发现将小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
单克隆抗体(monoclonal antibody,M cAb)具有结构均一、纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少或无等优点,缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性,反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答,从而削弱其作用,甚至导致免疫病理损伤。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产等一系列实验步骤。
下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前的准备(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功,获得高质量的M cAb 至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性而定。
1.颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。
下面以细胞性抗原为例:免疫细胞数为每只小鼠1×107/0.5 m L生理盐水,腹腔注射。
1)初次免疫,间隔2～3周。
2)第二次免疫,间隔3周。
3)第三次免疫10天后,取血测效价。
4)加强免疫3天后,取脾融合。
2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂。
将抗原与佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状(放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态)。
1)初次免疫,Ag5～50微克/只,加弗氏完全佐剂皮下多点注射,一般0.2毫升/点,间隔3周。
2)第二次免疫,剂量途径同上,加弗氏不完全佐剂,间隔3周。
3)第三次免疫,剂量同上,不加佐剂,于生理盐水中腹腔注射,7～10天后采血测其效价,检测免疫效果,间隔2～3周。
4)加强免疫,剂量50μg为宜,腹腔或静脉注射。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则(2003)
2003 年 03 月 20 日发布本要点合用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，合用于在人体内应用的利用重复 DNA 技术制备的基因工程抗体。
一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体(一)杂交瘤细胞1．亲本细胞(1)骨髓瘤细胞SP2/0 或者其他适宜的骨髓瘤细胞系。
应为不合成或者不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。
(2)免疫亲代细胞经抗原免疫的鼠脾 B 淋巴细胞或者外周血 B 淋巴细胞。
应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。
适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。
2．细胞融合与克隆化采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。
3．杂交瘤细胞检定(1)抗体分泌稳定性连续克隆化后抗体阳性率达 100%，经体外连续传代 3 个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。
(2)细胞核学特征检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。
4．鼠源病毒检查按附录要求检测鼠源病毒。
5．支原体检查按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
6．无菌试验按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
(二)单克隆抗体的检定1．免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法或者其他适宜的方法测定。
2．亲和力用可靠、准确的方法测定单克隆抗体 (以下简称为单抗) 的亲和常数或者相对亲和力。
普通情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。
3．特异性测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。
4．交叉反应按附录要求。
免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。
来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。
5．效价测定用适宜方法测定。
(三)其他原材料1．细胞培养用小牛血清支原体检测应为阴性。
经小量试验适于杂交瘤细胞生长。
2．培养液应有培养液来源，质量指标。
单克隆抗体的标记(酶标记、荧光素标记、同位素标记和生物素标记)
单克隆抗体的标记(酶标记、荧光素标记、同位素标记和生物素标记)目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。
下面将介绍最常用的几种标记技术。
一、酶标记1、辣根过氧化物酶（HRP）标记辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与 IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：（1）将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
（2）加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
（3）加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。
（4）称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。
（5）用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。
（6）将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。
（7）酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。
简述单克隆抗体制备原理。
简述单克隆抗体制备原理。
单克隆抗体是一种通过人工合成而获得的高度特异性的抗体,通常用于检测、诊断和治疗各种疾病。
单克隆抗体的制备原理主要涉及以下几个步骤:
1. 细胞培养:选择适当的细胞系,如B细胞或T细胞等,将其培养在适宜条件下。
2. 分子标记:使用一定的技术和分子标记技术,如荧光标记、放射性标记等,将目标分子或目标分子的基因编码序列引入细胞中。
3. 基因重组:利用基因工程技术,如基因重组载体、基因编辑工具等,将目标分子的基因与相应的单克隆抗体基因进行重组。
4. 表达和处理:将重组后的单克隆抗体基因导入细胞中,使其表达目标分子。
随后,对表达后的单克隆抗体进行筛选和纯化。
5. 扩增和制备:利用适当的扩增技术和设备,如PCR、冻存技术等,将筛选得到的单克隆抗体进行扩增,并制备成所需的浓度和规模。
单克隆抗体制备的原理是基于人工合成抗体的概念,通过分子标记和基因工程技术,将目标分子的基因与单克隆抗体基因进行重组,
使其在细胞中表达并产生高特异性的抗体。
随后,通过筛选、纯化和扩增等技术,获得所需的单克隆抗体。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则(2003)
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则2003年03月20日发布本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体。
一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体（一）杂交瘤细胞1．亲本细胞（1）骨髓瘤细胞SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。
应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。
（2）免疫亲代细胞经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。
应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。
适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。
2．细胞融合与克隆化采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。
3．杂交瘤细胞检定（1）抗体分泌稳定性连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。
（2）细胞核学特征检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。
4．鼠源病毒检查按附录要求检测鼠源病毒。
5．支原体检查按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
6．无菌试验按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。
（二）单克隆抗体的检定1．免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。
2．亲和力用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。
一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。
3．特异性测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。
4．交叉反应按附录要求。
免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。
来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。
5．效价测定用适宜方法测定。
（三）其他原材料1．细胞培养用小牛血清支原体检测应为阴性。
经小量试验适于杂交瘤细胞生长。
2．培养液应有培养液来源，质量指标。
I标记单克隆抗体技术
125I标记单克隆抗体技术同位素标记是一种重要的抗体标记技术，牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。
McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外，还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。
(一) 原理氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I２氧化为I＋并结合到氨基酸上。
如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。
(二) 方法在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg／100μl，再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液再加入10μl(含1mCi)125I↓加入10μl氯胺-T(5mg／ml溶于0.05M磷酸盐缓冲液)，孵育时间不超过30秒↓加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg／ml溶于0.05M磷酸缓冲液)↓加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M磷酸缓冲液＋4％牛血清白蛋白)↓用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I用4％BSA PBS洗脱↓分部收集，0.5ml／管每管取5μl进行γ计数，计算标记抗体的比活性和标记率结合于McAb１２５I放射性强度(cpm)标记率(％)＝───────────────────总放射性强度(cpm)结合于某一管McAb上的放射性强度比活性(μCi／μgMcAb)＝────────────────某一管McAb总量(三) 试剂器材1. 纯化后的McAb2. 0.05M磷酸缓冲液，氯胺桾，偏重亚硫酸钠，KI，BSA3. 125I4. 有通风装置的超净台，γ计数仪5. PD10柱(Sephadex G25)(四) 注意事项1. 严防同位素污染，工作人员必须穿着工作衣，戴口罩、帽子、手套。
必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。
操作前后对实验室环境进行监测。
所用125I和标记物应妥善保管。
2. 如标记细胞因子、激素等，应选用更温和的标记方法，使保持更好的生物学活性。
单克隆抗体
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 液氮储存器
是细胞培养室的必要设备。杂交瘤细胞需要在液氮储 存器中保存。
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 水浴恒温装臵
主要设备
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 冰箱
各种培养用的溶液，如培养液、 生理盐水、消化液、血清等都要储 存在0度或更低的温度条件下，普 通冰箱是单克隆抗体制备的必需设 备。血清、酶、消化液和配制好的 抗生素等溶液，需要低温保存以防 失去活性。不同生物制品要求保存 温度不同，有的在保鲜温度（4 度），有的则必须低温保存。因此， 尚须配臵-20度以下的低温冰箱。
培养基
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• DMEM、RPMI-1640。
• 配制时干粉制剂搅拌全溶后，加水到需要 的体积。 • 除菌过滤分装。 • 使用前根据需要再加入适量的牛血清、抗 生素、碳酸氢钠、丙酮酸盐和谷氨酰胺等 成分。
血清
组 织 培 养 材 料 的 准 备
• 血清体外细胞培养中不可缺少的成分 。 • 牛血清分胎牛血清和小牛血清两种 。 • 实验前须对不同来源及批号的血清进行 筛选。 • 融合亲代细胞的培养一般采用含10％胎 牛血清培养基。但在融合、筛选及随后 的克隆中一般用含20％的胎牛血清培养 基。 • 根据需要在用前将胎牛血清灭活 。
B cell
-b -a
-c -d
脾 细 胞
传统抗体 (抗血清) 对 抗 原 的 反 应
细胞融合
PEG HAT -a -b Cell fusion
分株培养筛选
a b c d
+ + + +
-c
-d ELISA
抗体FITC标记操作流程记录
1.目的规范单克隆抗体标记荧光FITC (快速标记法）标准操作程序2.适用范围适用于本公司抗体标记荧光FITC (快速标记法）操作3.术语和定义单克隆抗体采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)。
其标记原理: FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加（异）硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记。
4.职责和权限实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.5.1溶液配制0.01mol/L PBS溶液配制0.01 mol/L Phosphate Buffered Saline，pH 7.40试剂名称配方量批号用量Water 1LNaCl（MW 58.44）0.799gKH2PO4（MW 136.09）0.2gKCl（MW 74.55）0.2gNa2HPO4·12H2O2.89g（MW 358.14）调节pH 7.40后，加水定容至1.0L，再调节pH至7.40，过滤备用。
Storage Buffer，pH 7.40试剂名称配方量批号用量0.01mol/L PBS /BSA 0.5%NaN30.1%调节pH 7.40后，加水定容至1.0L，再调节至pH 7.40。
5.2其他试剂试剂名称厂家批号活化液（modifier）淬灭剂（quencher）FITC荧光素6.操作流程6.1抗体活化将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与FITC反应形成共轭物将抗体混合液（步骤6.1）加入mg FITC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
铕螯合剂对甲胎蛋白单克隆抗体标记的研究
２．３ 标 记抗体 的荧光强 度
标记前 后 ＡＦＰ—ＭｃＡｂ的浓 度 ，如 表 ２所 示 。根
据标 记抗 体的荧 光强 度计 算 回收率 和标 记率 ，如表 ３ ２．４ 标 记 抗 体 免 疫 活 性
所 示 。 回收 率 一标 记 抗 体 （ｍｇ／ｍ１）ｘ 标 记 后 体 积
探 究铕 螯 合 剂 标 记 对 ＡＦＰ—ＭｃＡｂ免疫 活 性 的
ｌ／孔 ，冲洗 ５次 ，拍 干 ；加 显 色液 １００ Ｊ／孔 ，３７℃孵 育 １０ ｍｉｎ；加 入终 止液 ５０ １／孔 ；在 酶标 仪上 进行 检 测 ，读 取 ０Ｄ值 。 ２ 结 果 ２．１ 铕 螯 合 剂 的 特 点
铕 螯合 剂 的结 构式 如 图 １所示 ，它是 双 功 能穴 状 螯合 剂 。该铕 螯合 剂 含 有 吡 啶一２，２－联 吡 啶结 构 ， 通 过共 价形 式将 铕离 子包 绕在 内 ，当受到 激发 时 ，该
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ａｌｐｈａ—ｆｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ—ＭｃＡｂ）ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ
ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｃｒｙｐｔａｔｅ．Ｍ ｅｔｈｏｄｓ Ｅｕｒｏｐｉｕｍ ｃｒｙｐｔａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＥＤＣ ａｎｄ Ｎ ＨＳ ｗｅｒｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｉｎｔｏ ＡＦＰ—Ｍ ｃＡｂ．Ａｆｔｅｒ ｄｉａ—
简述单克隆抗体的应用
简述单克隆抗体的应用一、引言单克隆抗体是一种由单一的B细胞克隆所产生的特异性抗体，具有高度的特异性和亲和力，已经被广泛应用于医学、生物学、生命科学等领域。
本文将详细介绍单克隆抗体在这些领域中的应用。
二、医学应用1. 肿瘤治疗单克隆抗体可以通过靶向肿瘤表面分子，诱导肿瘤细胞凋亡或者激活免疫系统攻击肿瘤细胞。
例如，Herceptin是一种针对HER2阳性乳腺癌的单克隆抗体，它可以结合HER2受体并阻止其信号传导通路，从而促进癌细胞死亡。
2. 自身免疫疾病治疗自身免疫疾病是由于机体免疫系统攻击自己正常组织而引起的多种临床表现。
单克隆抗体可以通过靶向和中和自身免疫反应中关键分子来治疗这些疾病。
例如，Humira是一种针对肿瘤坏死因子的单克隆抗体，可以用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫疾病。
3. 感染性疾病治疗单克隆抗体可以通过靶向和中和感染性病原体来治疗感染性疾病。
例如，ZMapp是一种用于治疗埃博拉出血热的三个单克隆抗体的混合物。
三、生物学应用1. 免疫印迹和免疫组化单克隆抗体可以用于检测蛋白质表达或定位。
例如，使用特定的单克隆抗体可以检测细胞中特定蛋白质的表达水平或者在细胞中的位置。
2. 流式细胞术单克隆抗体可以用于流式细胞术，通过结合细胞表面分子来鉴定和区分不同类型的细胞。
例如，使用CD4单克隆抗体可以区分T helper细胞和其他类型的淋巴细胞。
3. 免疫沉淀单克隆抗体可以用于纯化特定蛋白质或复合物。
例如，使用特定的单克隆抗体可以纯化含有目标蛋白质的复合物。
四、生命科学应用1. 基因工程单克隆抗体可以用于基因工程，通过将它们与其他分子如荧光蛋白或酶结合，来实现对细胞或组织中特定分子的检测。
例如，使用绿色荧光蛋白标记CD4单克隆抗体可以在T helper细胞中检测CD4表达水平。
2. 蛋白质工程单克隆抗体可以用于蛋白质工程，通过改变它们的结构或者序列来增强它们的亲和力和特异性。
例如，使用基因重组技术可以将两个不同的单克隆抗体结合成一个双特异性抗体。
Iodogen法125I标记CD28单克隆抗体2F5的方法
０ ０ ） 与 国内文献报告一致 。 ．５ ，
ＣＳ Ａ ０被认为是一 种广谱 的肿 瘤标 志物 ， 主要分 布 于糖 脂及 高分子蛋 白中， 同肿瘤患者血清 的阳性率 不 同 。本 不 文结 果表 明 ， 乳腺 癌患者在 术前血 清 Ｃ ５ Ａ ０水平非常 显著地 高于正常人组 （ ０ ０ ） 术 后 ６个 月与 正常人 组 比较无 显 Ｐ＜ ．１ ，
后经 手术 后病理切片证实 ） 。其 中浸润 性导管癌 ２ ８例 、 单纯 癌 ２例 、 原位癌 ２例 ， 术后 根据病情分别采用 化疗 、 放疗或 内 分 泌治疗或综合治疗 。 １１ ２ 正常人组 ：５人 ， ．． ３ 均为我 院体检 中心经健康体 检合格
的正常人 ， 无心 、 、 、 肝 肺 肾等重要脏器 疾患 ， 肾功 能试验正 肝 常， 且无乳腺疾患 。
射 免 疫 杂 志 ２）２牛 ２ （ １ ５器 第 ｌ期 Ｊｏ Ｒ ｄｏｍ ｎｌ￣２ １ ２ （ ｔ ａｉｉｍｕ ｏ ：０ ２，５ １ ｏ
一
１ — ５
０ Ｏ ） 术后 ６个月 则 与正 常人 组 比较 无 显著 性 差 异 （ ．１ ， Ｐ＞
１ 资 料 和方 法
１１ 临床一般资料 ．
所测 数据以 ±ｓ 示 ， 表 组间 比较 采用 ｔ 验 ， 检 相关 分析 采用
： 回归 。 直线
Ｃ Ｆ水平的变化 ， Ｓ 可作为肿瘤 的诊断和疗效 的观察。
２ 结果
２ １ 正常 人 组 和乳 腺 癌 患者 手 术 治疗 前 后 血 清 Ｃ ５３ ． Ａ１－、 Ｃ５ Ａ ０和 Ｍ． Ｓ Ｃ Ｆ含量 ， 见表 １ 。
烷将其溶解 （ ｇＬ ， １ 不 同量 的 Ｉｄｇｎ加入 反应管底 １／ ） 取 Ｏ ｏｏｅ 部， 用氮气吹干 ， 反应管底部 形成均匀 的薄膜 ， 涂好 的反 使 将 应管放 人内有干燥剂的塑料袋内密封 ， 一２℃保存备用。 置 ０
单克隆抗体浓度测定方法
单克隆抗体浓度测定方法单克隆抗体浓度测定单克隆抗体浓度测定是一项关键的实验技术，用于确定单克隆抗体在样本中的浓度。
本文将介绍几种常用的测定方法。
ELISA法ELISA法是最常用的单克隆抗体浓度测定方法之一。
以下是ELISA 法的步骤：1.涂覆：将抗原溶液均匀涂覆在酶标板上。
2.固定：将酶标板放置在低温环境中，使抗原固定在酶标板上。
3.阻断：加入非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻止非特异性结合。
4.反应：加入待测样本和单克隆抗体试剂，并孵育一段时间。
5.洗涤：用缓冲液洗涤酶标板，去除未结合的物质。
6.显色：加入底物溶液，使酶标板上的酶催化反应发生显色。
7.停止反应：加入停止剂，停止酶催化反应。
8.测定：用酶标仪测定反应溶液的吸光度，根据标准曲线计算待测样本中单克隆抗体的浓度。
Western Blot法Western Blot法也被广泛应用于单克隆抗体浓度测定。
以下是Western Blot法的步骤：1.蛋白质电泳：将待测样本和已知浓度的单克隆抗体样品进行SDS-PAGE电泳分离。
2.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到聚乙烯二醇膜（PVDF）上。
3.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）阻止非特异性结合。
4.孵育：加入标记有特异单克隆抗体的二抗，孵育一段时间。
5.洗涤：用缓冲液洗涤膜，去除未结合的物质。
6.显色：加入底物溶液，使特定蛋白质产生显色反应。
7.测定：用图像分析系统测量显色带的强度，根据已知浓度的单克隆抗体样品构建标准曲线计算待测样本中单克隆抗体的浓度。
免疫组化法免疫组化法是通过单克隆抗体与待测样本中的特定抗原结合来测定单克隆抗体浓度的方法。
以下是免疫组化法的步骤：1.取样：采集待测样本，如血液或组织切片。
2.固定：使用适当的固定剂将样本固定在载玻片上。
3.渗透：使用适当的加热或酶处理方法，增加抗体对抗原的渗透性。
4.成像：加入标记有荧光物质或酶标记的单克隆抗体试剂，与样本中的特定抗原结合。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的物质。
单克隆抗体 平均荧光强度
单克隆抗体平均荧光强度单克隆抗体（Monoclonal antibodies）是由单一免疫细胞株分泌的抗体所构成的一类抗体。
相比于多克隆抗体，单克隆抗体有着更高的特异性和一致性，因此在科研和临床应用上具有较大的优势。
单克隆抗体的荧光标记被广泛应用于细胞及分子生物学研究中，其中平均荧光强度是评价抗体质量的一个重要指标。
下面将介绍一些与单克隆抗体平均荧光强度相关的参考内容。
1. 单克隆抗体的制备方法：单克隆抗体的获得通常通过融合免疫细胞和癌细胞（如骨髓瘤细胞）来得到细胞株。
在单克隆抗体制备过程中，抗体的荧光标记通常是在抗体的分泌周期中添加配体分子或标记分子来实现的。
一般来说，光学物理学的研究结果表明，荧光染料的量会影响荧光强度。
因此，在制备单克隆抗体时，可以考虑优化荧光染料的配比，以达到更好的荧光效果。
2. 荧光染料的选择：荧光染料在单克隆抗体的标记中起到了至关重要的作用。
荧光染料的选择应基于实验需要和光学性能。
根据文献报道，一些荧光染料在不同波长下会表现出不同的荧光强度，因此在选择荧光染料时需要充分考虑实验的要求和具体的波长条件。
3. 免疫荧光检测方法：免疫荧光检测是单克隆抗体荧光标记应用的主要方法之一。
通过将目标分子与荧光标记的单克隆抗体结合，可以实现对目标分子在细胞或组织中的可视化检测。
一般来说，免疫荧光检测的结果可以通过流式细胞仪、荧光显微镜或荧光成像系统等设备来定量分析。
相关研究指出，流式细胞仪在免疫荧光检测中对于测量荧光信号的强度有着较好的灵敏度和分辨率。
4. 荧光信号增强方法：当荧光信号较弱时，可以考虑采用一些信号增强方法来提高荧光强度。
例如，可以通过多肽链或其他荧光增强剂与荧光标记的单克隆抗体结合，来增强荧光信号的强度。
某些蛋白质标记物，如辣根过氧化物酶和碳酸酐酶等，也可以用于增强荧光信号。
总结起来，单克隆抗体的平均荧光强度是评价抗体质量的重要指标之一。
通过选择合适的荧光染料、优化制备过程、合理选择荧光检测方法以及采用荧光信号增强方法，可以提高单克隆抗体的平均荧光强度，从而实现更好的荧光标记效果，并为后续的免疫检测和实验研究提供更可靠的数据依据。
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（1）在进行记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，备1ml凝胶柱，然后分别用10倍积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱，封住柱下口，备用。
（2）加入10ug纯化单抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸钠（PH7.5）的1.5ml指形管内。随后，加入500uCi Na125I混匀。
（2）用含2% PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸（每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗）。
（3）经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20积的1mol/L Tris（PH8.0）及叠氮钠至浓度0.02%。该记抗可按纯化单抗方法进行。
（5）将记单抗保存4℃可使用6周时间。
2、生物合法记
将杂交瘤细胞培养在含有放射性前的培养基中，随着抗分子的合、组装，同位素会记在抗分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗活性的丧失。其步骤是：
（1）离心收集处对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。
碱性磷酸酶（AP）用记抗，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗蛋白的NH2分别与两个醛基结合，备结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗活性损失大，酶记率低。其序如下：
（1）将5mg AP加入1ml抗溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，4℃对0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小时，换液三次。
序一：
（1）将5mg HRP溶0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。
（2）加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。
（3）加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。
3、PAP、APAAP的备
PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶技）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶技）的备对日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重意义。在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只配以相应的桥抗，即可非常便利地应用单抗。为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗，它们的活性均不受化学素的影响，提了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。
（4）将交联物经Sephadex G25或G50柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为记的抗。
（5）FITC的结合物质量鉴定
IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4
F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般说，FITC对抗的摩尔比为3：1时适合组织切片染色，为5-6：1时适合细胞悬液染色。以记抗染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的度。
目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为记的单抗。下面将介绍最常用的几种记技。
一、酶记
1、辣根过氧化物酶（HRP）记
辣根过氧化物酶（HRP）记单抗和多克隆抗的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化醛基，加入抗IgG后该醛基与IgG氨基结合，形Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种序。
根据需还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗结合后，再与特定单抗组完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用诊断或检测试验等。
二、荧光素记
1、异硫氰酸荧光素（FITC）记
FITC记抗的原理是在碱性条件下，FITC 的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双记组合。其记步骤如下：
（6）将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。
（7）酶结合物质量鉴定：
克分子比值测定
酶量（mg/ml）=OD403×0.4
IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62
克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×积/抗，记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗分子上，记率可大0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等0.4时，E/P约为1。
（5）再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。
（6）用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必时进一步层析纯化。
（7）、（8）步骤同序一。
2、碱性磷酸酶（AP）记
（2）加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。
（3）换用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。
（4）取出记抗，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP记物原液。
（5）每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。
（3）加入25ul新配的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。
（4）将上述碘记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱下口，用1.5ml指形管收集。当碘记物全部进入柱，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定记与未记的单抗。记抗大约在第二至第四管出。无害化处理柱子和非单抗记部分。
（6）记抗的保存：宜保存4℃，加NaN3防腐。
2、异硫氰酸罗丹明（TRITC）记： 基本与FITC记相同。
三、同位素记
必须强调的是在使用同位素记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防知识。正常情下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保，操作和使用同位素记抗时，应利用防装置，并合理处置含放射性的废料。
1、碘记
用碘记抗是一种有效的记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化I2，游离I2可与抗分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将记的抗与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其操作步骤如下：
序二：
（1）将5mg HRP 溶0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。
（1）以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸馏水1000ml）调整抗浓度至10mg/ml。
（2）取5ml抗溶液置10ml小烧杯中。
（3）称取1mg FITC溶0.2ml DMSO中，待溶解后立即缓慢滴加抗液内，边加边轻搅；其后室温避光作用2小时。
四、生物素记
生物素记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完记。其步骤是：
1、用二甲基亚砜配10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。
2、用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至1-3mg/ml。
记率=OD403/OD280
酶活性和抗活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗活性及效价、特异性。
（8）HRP抗结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保剂。
（4）称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。
（5）用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V积新鲜配的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。
3、每毫克抗加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。
4、按每250ug生物素酯加入20ul 1mol/L NH4Cl终止反应，室温放置10分钟。
5、以PBS充分透析除去游离生物素，记抗冻存。
五、其他记技
适用蛋白质的其他记方法也可用单抗，如金记、化学发光记、SPA记、铁蛋白记等。
（3）移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。
（4）吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。