中国黑色素瘤患者 BRAF基因突变分析

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【ＫｅｙＷｏｒｄｓ】ＢＲＡＦ；Ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｍｅｌａｎｏｍａ
肿瘤的形成是一个多基因突变累积的过程，肿瘤基因突变检测的研究是生命科学研究领域的热点。国外学者对黑色素瘤患者肿瘤细胞的基因突变情况做了大量的研究，结果显示黑色素瘤细胞基因
１１００１４２北京肿瘤医院恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室２通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｊ３０７＠１２６．ｃｏｍ
因而，针对ＢＲＡＦ及其下游激酶的小分子靶向药物，近年来在抗肿瘤药物研发中倍受关注。已有的国外
·５８ ຫໍສະໝຸດ Baidu ·
手动分离石蜡包埋组织中的肿瘤细
胞，基因组ＤＮＡ提取按照试剂盒说明书进行（ＱＩＡａｍｐＤＮＡＦＦＰＥＴｉｓｓｕｅＫｉｔ）。采用巢式ＰＣＲ扩增ＢＲＡＦ基因外显子１１和１５。引物序列如下：外显子１１：外侧上游引物，５ ’ ＣＡＧＧＴＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴ ’ ，外侧下游引物，５ ’ ＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴ３ＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣ３ ’ ；内侧上游引物，５ ’ ＡＡＣＣＡＴＴＴ ’ ，内侧下游引物，５ ’ ＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡ３ＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＣＴ３ ’ 。外显子１５：外侧上游引物与内侧上游引物相同，５ ’ ＴＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧ３ ’ ，外侧下游引物，５ ’ ＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＡＣ３ ’ ，内侧下游引物，５ ’ ＧＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡ３ ’ 。由于黑色素的存在会抑制ＤＮＡ的扩增，故依据文献
ＭＭ）ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｅｘｏｎ１１ａｎｄ１５ｏｆＢＲＡＦｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｏｆ９０ｃａｓｅｓｏｆｒａｌｓｋｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔｍｅｌａｎｏｍａ（ＣｈｉｎｅｓｅＭＭｐａｔｉｅｎｔｓｂｙＰＣＲ；ｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｂｏｔｈｅｘｏｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＢＲＡＦｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｉｎｍｕｃｏｓａ，ａｃｒａｌａｎｄｎｏｎａｃｒａｌｓｋｉｎＭＭｔｉｓｓｕｅｓｗａｓ２３３％（７／３０），１６７％（５／３０）ａｎｄ４３３％（１３／３０）．Ｏｎｅｃａｓｅｉｎ２５ｗａｓｔａｎｄｅｍｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄ２４ｗｅｒｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｌｉｅｄｉｎｅｘｏｎ１１ａｎｄ２４ｌｉｅｄｉｎｅｘｏｎ１５，ａｎｄＶ６００Ｅｃｏｍｐｒｉｓｅｓ８３３％ｏｆａｌｌｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｅｘｏｎ１５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＢＲＡＦｍｕｔａｔｉｏｎｉｓｆｒｅｑｕｅｎｔｉｎｎｏｎａｃｒａｌＭＭｏｆＣｈｉｎｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄｍｏｓｔｉｎｅｘｏｎ１５ｗｉｔｈＶ６００Ｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｒｅｎｄｅｒｓｉｔａｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｔｏｂｅｓｔｕｄｉｅｄ．
［５］
Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１：阴性对照；２～７：外显子１５标本
图２ＢＲＡＦ外显子１５凝胶电泳鉴定图２２ＢＲＡＦ基因在黏膜、肢端和非肢端皮肤恶性黑０例黑色素瘤组织中共检测色素瘤中的突变率９出ＢＲＡＦ基因突变２５例，黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤组织中突变率分别为２３３％（７／３０）、１６７％（５／３０）和４３３％（１３／３０）。２３ＢＲＡＦ基因突变类型和分布区域２５例ＢＲＡＦ基因突变中，１例为串联突变，其它均为点突变；１例突变位于ＢＲＡＦ基因第１１外显子，即Ｇ４６６Ｒ（Ｇ１３９６Ａ）突变，其余２４例均位于ＢＲＡＦ基５外显子，其中Ｖ６００Ｅ（Ｔ１７９９Ａ）突变２０例，因第１其它４例突变分别为Ｓ６１６Ｆ（Ｃ１８４７Ｔ）、Ｋ６０１Ｅ（Ａ１８０１Ｇ）、Ｄ５９４Ｇ（Ａ１７８１Ｇ）及串联突变Ｖ６００Ｋ（Ｇ１７９８Ａ、Ｔ１７９９Ａ）。ＢＲＡＦ基因第１５外显子突变比例占所有ＢＲＡＦ突变的９６０％，并且Ｖ６００Ｅ突变占所有ＢＲＡＦ第１５外显子突变的８３３％（２０／２４）。
【关键词】ＢＲＡＦ；基因突变；黑色素瘤
中图分类号：Ｒ７３９５文献标识码：Ａ文章编号：１００９－０４６０（２００９）０７－０５８５－０４
ＢＲＡＦｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｍｅｌａｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓＺＨＵＹａｎｙａｎ，ＳＩＬｕ，ＣＨＩＺｈｉｈｏｎｇ，ＣＵＩＣｈｕａｎｌｉａｎｇ，ＳＨＥＮＧＸｉｎａｎ，ＬＩＳｉｍｉｎｇ，ＨＡＮＭｅｉ，ＧＵＯＪｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｎａｌＣａｎｃｅｒａｎｄＭｅｌａｎｏｍａ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｓｃｈｏｏｌｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ＆Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１４２，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＧＵＯＪｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｊ３０７＠１２６．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＢＲＡＦｉｎＣｈｉｎｅｓｅｍｕｃｏｓａ，ａｃｒａｌａｎｄｎｏｎａｃ
临床肿瘤学杂志２００９年７月第１４卷第７期ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ．２００９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７
研究只包含了极少的亚洲人数据，但仍提示我们亚洲黑色素瘤从基因水平方面就与欧美白种人有很大的区别。而关于中国人黑色素瘤ＢＲＡＦ基因突变情况目前尚无相关的报道。因而，我们收集了我院９０例黑色素瘤患者的组织标本，进行了中国人黑色素瘤ＢＲＡＦ基因突变情况的研究，以期发现其与西方白种人所存在的差异。１资料与方法１１研究对象收集北京肿瘤医院肾癌黑色素瘤内科２００６～２００８年住院和门诊患者的病灶组织蜡块９０例，均经ＨＥ染色和病理诊断证实。９０例患者分别为黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤各３０例。１２肿瘤基因组ＤＮＡ提取和ＰＣＲ扩增目的基因参照文献
变导致编码氨基酸的改变，可以通过模拟重要位点ＲＡＦ激酶的持续性活化，激活的磷酸化从而造成Ｂ
４］下游的信号传导通路，导致细胞无限制地生长［。
变在黑色素瘤中的发生率显著高于其他相关通路蛋白编码基因，在一些研究中其突变率高于６０％
［２］
。
ＢＲＡＦ蛋白由３个保守结构域（ＣＲ）组成。ＣＲ１包含２个Ｒａｓ结合位点Ｒａｓ结合结构域（ＲＢＤ）和
１］ＡＰＫ途径［，其中ＢＲＡＦ基因突突变主要集中在Ｍ
半胱氨酸富集结构域（ＣＲＤ）；ＣＲ２富含丝／苏氨酸ＣＲ３为激酶结构域，是行使功能的主要部分。残基；位于激酶结构域的Ｔ５９８和Ｓ６０１两个位点的磷酸化
３］对于ＢＲＡＦ蛋白的激活至关重要［。ＢＲＡＦ基因突
临床肿瘤学杂志２００９年７月第１４卷第７期ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ．２００９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７
·５８５ ·
·论著·
中国黑色素瘤患者ＢＲＡＦ基因突变分析
０例中国恶性黑色素瘤（ＭＭ）患者肿瘤组织中ＢＲＡＦ外显子１１和１５的突变情况。结果：黏膜、肢端和非直接测序方法检测９肢端皮肤黑色素瘤患者肿瘤组织中ＢＲＡＦ基因的突变率分别为２３３％（７／３０）、１６７％（５／３０）和４３３％（１３／３０）；２５例ＢＲＡＦ基因突变中，１例为串联突变，其它均为点突变；仅有１例ＢＲＡＦ基因突变位于第１１外显子，其余２４例均位于ＢＲＡＦ第１５外显子。Ｖ６００Ｅ突变占所有ＢＲＡＦ基因第１５外显子突变的８３３％（２０／２４）。结论：ＢＲＡＦ基因在中国人非肢端皮肤黑色素瘤中突变率较高，且以该基因第１５外显子Ｖ６００Ｅ点突变为主，有可能成为靶向药物作用的靶点。
１００１４２北京北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所肾癌黑色素瘤内科
，２朱琰琰１，斯璐１，迟志宏１，崔传亮１，盛锡楠１，李思明１，韩梅１，郭军１
【摘要】目的：探讨ＢＲＡＦ基因在中国人黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤中的突变率和类型。方法：用ＰＣＲ扩增和
［５］
ＲＡＦ外显子１１的ＰＣＲ产物。其中ＢＲＡＦ同样本Ｂ外显子１１的ＰＣＲ产物长度为３０４ｂｐ。见图１。
Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１：阴性对照；２～７：外显子１１标本
图１ＢＲＡＦ外显子１１凝胶电泳鉴定图２１２ＢＲＡＦ外显子１５凝胶电泳图８个泳道从左至右依次为：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ、阴性对照、６个不同样本ＢＲＡＦ外显子１５的ＰＣＲ产物。其中ＢＲＡＦ外显子１５的ＰＣＲ产物长度为３１４ｂｐ。见图２。