蛋白免疫印迹杂交(Western+Blot)技术手册

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Western Blot实验指导教程

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot，WB）一、蛋白提取与样本制备（一）操作步骤1.提前解冻RIPA（蛋白裂解液），一定要完全融化；2.根据样本数配制混合溶液：PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）：RIPA=1：100，现用现配）；3.裂解组织：每个样品称取50mg，加1ml混合液，在冰上用组织剪剪减为碎屑，电动匀浆后4 ℃静置2h使其充分裂解，离心12000g，4 ℃15min，取上清；4.蛋白定量：1)取少量上清稀释10倍：2ul上清，加18ul生理盐水；2)标准品按5ug/ul至0.3125ug/ul的梯度进行倍比稀释（制作平行样的标准曲线：5mg/ml标准品取80ul + 生理盐水80ul）；3)配制显色剂BCA混合液：a液：b液=50:1。

配制量=200ul*（孔数+6）；4)加入稀释完成的各样到酶标板的孔中及BCA混合液200ul/孔；5)贴上封口胶，37℃震荡混匀30min；6)562nm波长处测吸光度OD；7)根据数据制图、添加趋势线、方程及R2。

5.样品OD值带入方程，计算出各样本原液蛋白浓度；6.样本蛋白浓度均一化（一般样品蛋白浓度为3-4mg/ml）；7.100℃变性5min。

8.分装并存于-20 ℃，避免反复冻融。

二、配置相关试剂（一）10%的SDS（戴口罩称取）：试剂剂量SDS （g）10双蒸水（ml）80用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。

室温保存，如在长期保存中出现沉淀，加温溶化后，仍可使用。

（二）1.5M Tris/HCl（pH8.8）试剂剂量Tris base （g）18.17双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH 8.8，最后定容至100ml。

室温下保存。

（三）0.5M Tris/HCl（pH6.8）试剂剂量Tris base （g） 6.06双蒸水（ml）80用浓盐酸调至pH6.8，最后定容至100ml。

室温下保存。

（四）丙/双丙（戴口罩称取）试剂剂量丙烯酰胺（Acr）（g）75亚甲双丙烯酰胺（g） 2去离子水（ml）230加热溶解后，定容至250ml，4℃棕色瓶避光保存。

Western Blot使用技术手册

生物医药基地western blot技术手册1.western blot 主要试剂的配方1.1 5×电泳缓冲液配方(1L)注意事项：a.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至1×使用。

1.2 1×转膜液配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后加入甲醇溶液，最后用纯水定容至1L（甲醇气味大，通风厨内配制，并注意戴口罩）。

b.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。

1.3 10×TBS配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调节溶液的PH至7.6（一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调节PH至7.6即可）。

b.使用PH计调节溶液的PH前，要按照说明书校准PH计。

c.PH调节至7.6后，用纯水定容至1L，使用时稀释10倍至1×使用。

d.配制TBST时，在1×TBS中按照1:1000的比例加入吐温20充分混匀即可。

1.4 30%丙烯酰胺单体储存液配方（100ml）注意事项：a. 将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37℃完全溶解，用纯水定容至100ml。

b. 用装0.45µm膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。

c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。

1.5 上液（1M Tris-HCl PH=6.8）配方（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至6.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

1.6下液（1M Tris-HCl, pH8.8 ）（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至8.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

2. Western Blot 主要流程2.1蛋白样品的提取2.1.1常用裂解液及其特点2.1.2 医药基地常用蛋白质提取方法⑴RIPA强裂解法：a. 取适量胰酶消化细胞（针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS，向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA强裂解液（80ul ——200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。

蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交 Western Blot 技术手册蛋白免疫印迹杂交 Western Blot WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离再转移到杂交膜blot 上然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析有助于成功完成WB。

A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳 1 PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker 3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳 C 转膜与显色Western Blot 1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测丽春红4膜的封闭 5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制2WB概述: 检测原理: 3A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步更是决定WB成败的关键步骤总体原则和注意事项 1 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2 保持蛋白的处于溶解状态通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择 3 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等低温操作加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 尽量去除核酸多糖脂类等干扰分子通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5 样品分装长期于-80℃中保存避免反复冻融。

A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA 附录1 全蛋白抽提试剂盒细胞质可溶蛋白 Tris-HCl 附录1 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton 附录1 蛋白分级抽提试剂盒细胞质磷酸化蛋白磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1 膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA 附录1 核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA 附录1 线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂种类与量见本节2 2 吸净PBS 加入预冷的裂解液 1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask. 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4 4℃摇动30 min 5 4℃离心12000 rpm 20 min 根椐细胞种类不同调整离心力 6 轻轻吸取上清转移至新预冷的微量离心管中置于冰上即为蛋白样本弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中加入液氮冻结组织于冰上均质研磨长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer 冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时裂解液体积与组织样本量有适当比例最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml. 4 4℃离心12000 rpm 20 min 轻轻吸取上清转移至新预冷的微量离心管中置于冰上即为蛋白样本弃沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL 或按下表配制备注其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下所有步聚均需在通风橱中进行 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至9.0 6. 再煮沸至无色7. 重复上述过程直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford 法Lowry 法或BCA 法均有商品化试剂盒可选择操作简单、需分光光度计或酶标仪小牛血清白蛋白BSA 作为标准曲线。

蛋白免疫印迹杂交技术手册

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100
μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。
A-4 电泳上样样品的准备
5
A-4-1 变性、还原蛋白样本一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将
1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
1
2
4
8
12 16 20
去离子水（μL）
20 19 18 16 12
8
4
0
对应蛋白含量（μg）
0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
2. 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混
A-4-2 天然和非还原样本某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明
书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，因此 loading buffer 和电泳液中不加入
3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，
4 4℃摇动 30 min 5 4℃离心 12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.
A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解， 2 将组织块放在圆底的微量离心管或 Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80°C， 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml). 4 4℃离心 12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,

蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项

蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

BCA法。

2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。

煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。

煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。

蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。

(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

Western Blot 实验实用技术手册总结

Western Blot 实验技术手册Western Blot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。

目前Western Blot已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一.一、Western Blot基本操作流程图细胞/组织蛋白提取↓蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二.Western Blot操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).，4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford法、和Lorry法或BCA法，一般推荐用BCA法.BCA测定方法如下:A．酶标板操作2、根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀；3、各孔加入200μL BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。

WesternBlot蛋白免疫印迹法

3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。

0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。

2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。

68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。

避光，4℃保存。

（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。

用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。

5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。

用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。

6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。

调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。

7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。

充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。

使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。

8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。

室温保存。

10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。

蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册

蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。

A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。

(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验

蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。

包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

WesternBlot实验实用技术手册总结

Western Blot 实验技术手册Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待检测样本中的表达情况。

目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一 .一、 Western Blot 基本操作流程图细胞 / 组织蛋白提取↓ 蛋白定量、蛋白变性上样、电泳↓一转膜↓封闭↓孵育一抗↓洗膜孵育二抗↓洗膜底物孵育↓曝光或显色二. Western Blot 操作步骤1.蛋白提取、处理蛋白提取的质量直接决定着WB 结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品.对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS 漂洗 2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后吸净 PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，4℃离心 12,000 rpm ，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力），轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于 -80 °C，每约 5 mg 加入约 300 μl预冷的裂解液lysis buffer ，冰浴匀浆后置于4℃摇动 2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml,理想的蛋白浓度应为 1-5 mg/ml). ，4℃离心 12,000 rpm ， 20 min ，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford 法、和 Lorry 法或 BCA 法，一般推荐用 BCA 法 .BCA 测定方法如下:A ．酶标板操作1.标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂孔号 1 2 3 4 5 6 7 8蛋白标准溶液（μL）0 1 2 4 8 12 16 20去离子水（μL）20 19 18 16 12 8 4 0对应蛋白含量（μg）0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.02、根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B（ 50:1）配制适量 BCA 工作液，充分混匀；3、各孔加入 200 μ L BCA工作液；4、把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置 30 分钟，然后在 562nm 下比色测定。

WB实验技术手册

1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer：
蛋白位置
推荐 buffer
全细胞
NP-40 或 RIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
线粒体/细胞浆蛋白分离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳动物细胞（包括凋亡和非凋亡细胞）中分离出线粒体部分和胞浆部分，得到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和线粒体中分布的变化，如：WB，ELISA 等。操作过程简单、方便，不使用有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构。
积。分装然后保存在-20°C
注意：在煮沸过程中液体体积避免变化太大，可加瓶盖以免溶液过渡蒸发。需
在通风橱中操作。溶液变黄后即丢弃。
相关产品信息
目录号
产品描述
ab65621
Protease Inhibitor Cocktail (Aprotinin,Leupeptin,Pepstatin A,PMSF)
电泳时间：通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
二、转膜
杂交膜是 WB 进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个 WB 的实验是非常重要和关键的。可以根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，
选择合适的膜类型。
021-61130227/8/9
６
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体

蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示

C-1 胶中蛋白的检测电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。铜染法：电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入 0.3 M CuCl2 染色 5-10 分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于 0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。考马斯蓝法：用 40%双蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝 R-250 染液（凯基产品）室温染色 4 小时至过夜，保持摇匀，转入 67.5%双蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。 C-2 蛋白转膜
B 电泳
B-1 PAGE 胶的制备聚丙酰胺凝胶 PAGE 电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE 胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。
浸泡甲醇中 1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法：将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变
B-2 蛋白分子量 Marker 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪

蛋白免疫印迹技术(WesternBlot)介绍

低，2-5% 高，根据蛋白大小
• 上样
SDS-PAGE电泳
Staking gel Separating gel
转膜
• 膜的选择最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素
（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。 • 孔径
蛋白免疫印迹技术介绍
主要内容
• Western Blot原理 • Western Blot特点及应用 • Western Blot一般流程 • Western Blot常见问原理
• 混合样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离，凝胶中的蛋
一抗、二抗孵育
• 抗体选择 • 抗体稀释液 • 孵育条件 • 漂洗
显色
显色
• 化学发光检测
• 荧光法
显色
GE AI800凝胶成像系统
Western Blot 常见问题
• 样品制备样本保存蛋白酶抑制剂
• 抗体正规厂家，有示例图抗体保存一抗二抗匹配内参和对照
Western Blot 常见问题
法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度
SDS-PAGE电泳
• SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
Western Blot 应用
• 从混合蛋白样品中检测目的蛋白 • 目的蛋白的组织定位 • 目的蛋白的表达量分析 • 目的蛋白与其他大分子间相互作用

蛋白质免疫印迹实验WesternBlot

，将膜浸于其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温温育 1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗 4 次，每次 5 分钟，再加入 4- 氯萘酚显色液，加入 5μ1 的30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心操作并除去气泡，否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三操作步骤

WB 技术手册

适用于脂类含量较耗费时间长 40～
Folin －酚试肽键与 Cu2+螯合，形成蛋白对可达 1-1500μg/ml 高的样品测定，也能 60 分钟；操作要严
剂法
质一铜复合物，还原酚磷
耐受相当浓度的去格计时；颜色深浅
钼酸产生蓝色化合物，蓝
垢剂如 SDS。
随不同蛋白质变
ß-mercaptoethanol and DTT
蛋白状态
凝胶状态
loading buffer
电泳缓冲液
还原—变性
还原和变性
有 ß-mercaptoethanol 或有 SDS
DTT 和SDS
还原—天然
还原和非变性
有 ß-mercaptoethanol 或无 SDS
DTT ，无 SDS
氧化-变性
2X Laemmli buffer 4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl Check the pH and bring it to pH 6.8. SDS 的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的 SDS 数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此 SDS-PAGE 电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
凝胶浓度 (%)
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
A-1 细胞或组织裂解
A-1-1 细胞裂解
裂解液 Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*
目的蛋白分布定位
推荐裂解液 Lysis buffe

蛋白免疫印迹

蛋白免疫印迹(Western Blot)技术指南一、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术概览蛋白免疫印迹(Western Blot，以下简称WB)是利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。

一般我们使用WB都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，通常要以表达相对稳定的蛋白作为内部对照（内参），然后采用“灰度分析软件”检测目的蛋白及内参条带的表达强度，每组目的蛋白分别以内参作为对照进行比对和相对定量，以使实验结果更加准确。

同时，同一批样品至少进行技术重复三次，然后方可进行统计学分析。

WB灵敏度可达ng级，用ECL显色法理论上可达pg级。

二、蛋白免疫印迹(WB)实验所需仪器、材料及试剂（一）主要实验仪器制冰机、超声破碎仪、低温冷冻离心机、蛋白电泳/转膜仪、多功能酶标仪、LI-COR Odyssey成像系统（二）主要实验试剂与材料15ml离心管、玻璃组织研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提试剂(改进型RIPA配方，Bioss 产品货号C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量试剂盒(Bioss产品货号C05-02001)、30%丙烯酰胺-N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss产品货号C05-03004)、10%过硫酸铵(APS)(Bioss产品货号C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss产品货号C05-03008)、4×蛋白上样缓冲液(Bioss产品货号C05-03015)、蛋白Marker(Bioss产品货号C05-090006)、电泳缓冲液(Bioss产品货号C05-03010)、转膜缓冲液(Bioss产品货号C05-05003)、考马斯亮蓝染色液(Bioss产品货号C05-04001)、TBST缓冲液(pH7.4)(Bioss产品货号C5049)、PVDF膜(Bioss产品货号C55008)或NC膜(0.22µm)(Bioss产品货号C05-05002)、丽春红染色液(Bioss产品货号C05-04002)、脱脂奶粉(Bioss产品货号C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀释液(Bioss产品货号C05-07001)、HRP标记二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或荧光标记二抗(Bioss内部操作流程选用荧光二抗，Bioss产品货号bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀释液(Bioss产品货号C05-07002)、ECL发光液(Bioss产品货号C05-07004)、膜再生液(Bioss产品货号C05-03041)Western Blot操作流程图三、蛋白免疫印迹(WB)实验标准操作流程和技术要点（一）蛋白提取●组织样品蛋白提取方法1.用灭菌（预冷）的工具分离新鲜目的组织50mg-100mg，并用生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。

蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。