组培污染

1、植物组培污染防治问题
（1）污染的来源。

植物组培污染主要是霉菌、细菌和酵母菌引起的污染。

霉菌和酵母菌在培养条件下生长快，很容易观察到，而细菌潜伏期长，植物组织一般不表现症状，所以很难在前期和肉眼观察到[1]。

国外有关学者认为细菌污染的来源主要有三个：一是材料内部灭菌处理不好，这样造成的污染占污染总数的1/3～1/2。

二是在正常的灭菌的条件下，内生菌能够存活，这样的污染占污染源的1/4。

三是来自寄生植物的污染占1/4～1/2。

同时认为有些植物的昆虫和螨虫的体表带有霉菌的孢子和细菌，在九、十月份是重要的污染源，因多种植物昆虫处在大量繁殖阶段，此时大量昆虫造成的污染源最易造成组培污染的严重发生。

近六年来，我们通过对猕猴桃、樱桃、托柄菝葜及大花非洲菊初级培养污染的研究中发现，高温、多雨的环境更有利于污染的发生，而且随着植物材料年龄的增长，植物材料的健康状况不断恶化，组培污染也会更加严重。

另外，外植体的状况，环境条件和操作过程也是引起污染的主要原因。

（2）抗生素对细菌污染的防治。

植物组培污染的控制取决于灭菌技术、灭菌设备、外植体年龄和环境条件等许多方面。

尽管在植物组培过程中尽量使无菌条件更完善，但是污染还是经常发生，甚至有时整个实验室的组培苗突出污染而全部死亡，这是无法挽回的巨大损失，因此人们对细菌污染研究的较多。

细菌污染的消除有些研究人员希望用抗生素防治，抗生素可以直接加入到培养基中，也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。

但植物种类不同，所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同，还有的抗生素对污染消除根本不起作用，因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。

一般情况下，为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗，可在培养基中加入氨中噻肟头孢菌素、四环素、利福平和多粘菌素B分别以25mg/L、25mg /L、6mg/L和6mg/L浓度的混合物，可使细菌完全被消除。

另外，用头孢菌素Ⅱ和链霉素消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。

总之针对不同植物品种要想找到一种合适的抗生素处理组合是比较困难的，工作也较繁琐。

国内外有关学者都认为没有一种抗生素对所有的细菌都有效，即使有效，抗生素消除植物组培污染的方法也是暂时的解决方案，如果长期使用抗生素消除污染，必然对组培苗的生长、分化和生根造成一定的影响。

（3）真菌污染的防治。

抗生素消除细菌的研究比较多，但目前酵母菌污染的研究相对较少，G B Poulsen等（1988）[2]在苹果砧分裂组织微生物消除的研究中，测试了几种物质对酵母菌的毒性，虽然它们对植物材料都没有伤害，但是没有一种能够消除酵母菌。

胍类化合物是对两种酵母菌有毒的唯一复合物，但它对分裂组织有毒害作用。

霉菌污染的一个重要特点是迅速，难控制。

目前，关于霉菌污染的研究还很少，有人建议用防腐剂消除霉菌污染，但是还未见报到。

（4）常用防治污染方法。

目前外植体表面灭菌的方法除常规的氯化汞、双氧水、酒精和次氯酸钠外，用于厕所消毒的家净也是一种良好的表面杀菌剂。

G Rreustle等学者在对葡萄组织培养污染的研究中发现家净表面消毒效果很好，家净虽然效果极好，价格便宜，但内生菌潜伏期长，内寄生性强，危险性大，对内生菌而言，任何一种表面消毒剂对外植体的内生菌几乎都是无能为力的，除了在培养基中加入杀菌剂消除植物组培污染外，还有许多其他的方法减少污染，如用抗微生物药剂定期喷洒活植物新梢、在新梢或发芽期套袋法隔绝微生物的侵入等方法来获得外植体接种消毒成功率。

另外，培养环境和接种环境的各处不同，灭菌的方法以及新型杀菌设备的应用在植物组培污染中也起着一定的重要作用。

2、植物组培过程中的褐变问题
在植物组织培养过程中，部分外植体会产生褐化现象，这主要是由多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质而引起的，一般认为，在自然条件下，酚氧化酶和其底物处在正常组织内的不同部位，细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡，醌类物质水平较低；当细胞受伤或衰老时，酚氧化酶释放或合成，在合适的PH、温度等条件下，酚氧化酶、酚类（底物）和氧气聚合发生氧化反应，形成有毒有醌类物质。

所以，被切割的外植体在接种后，切面细胞中酚类物质被氧化成醌，致使切面迅速变成棕褐色或暗褐色，这些褐色物会逐渐扩散到培养基中，抑制细胞内其它酶的活性，毒害整个外植体组织。

影响组培外植体褐变的因子主要有：外植体酚类物质的含量、PPO活性上的差异、外植体的大小、培养基的成份、激素类型。

在植物组织培养中，一般都是从培养基的组成，如培养基的无机盐成份、蔗糖浓度、添加的激素的种类和浓度、加入吸附剂活性炭或PVP（聚乙烯吡咯烷酮）等来防治外植体褐化。

近三年来，笔者在托柄菝葜、美国红栌实验的丛生芽诱导中，也出现了严重的褐化现象，特别以MS作为基本培养基时，同时加入相同的植物生长调节剂的低盐培养基（B5和1/2MS）相比，褐化率高出1.2倍，这主要是在初期培养过程中，基本培养基中高浓度的盐可以促进酚类物质大量外渗，同时培养基中的Cu2+和Mn2+的存在可以刺激酚氧化酶的活性，促进醌的合成，加重外植体的褐化程度。

此外，6-BA添加量对于外植体的褐化也具有较大的影响，在同种培养基上，6-BA的添加量与外植体的褐化率成正相关[3]。

在实验中，当6-BA的添加量减少时，褐化率明显降低，这一结果表明，6-BA能促进酚类化合物的合成并具有刺激多酚氧化酶活性的作用。

细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。

化学污染
化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。

这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。

化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。

它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。

细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。

细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。

生物污染
生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。

细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在合适的环境中非常快速的生长。

这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。

·由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。

但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。

由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。

1956 年Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。

90年代初美国的一个调查发现，在该国的细胞培养中，至少有15%被支原体污染。

由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感，不引起pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。

细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象：1981 年对ATCC细胞株的调查显示：超过60 标记为其他细胞株的细胞居然是HeLa 细胞。

怎么样才能减少污染的机会？
减少化学污染
对于自己用粉末配制培养液的实验室来说，配制培养液要使用重蒸馏水，以减少带入化学污染的机会。

如果要添加NaHCO3，要选用纯度高的NaHCO3，最好是经过细胞培养测试的。

·由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。

但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。

由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。

1956 年Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。

90年代初美国的一个调查发现，在该国的细胞培养中，至少有15%被支原体污染。

由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素不敏感，不引起pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。

细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象：1981 年对ATCC细胞株的调查显示：超过60 标记为其他细胞株的细胞居然是HeLa 细胞。

怎么样才能减少污染的机会？
减少化学污染
对于自己用粉末配制培养液的实验室来说，配制培养液要使用重蒸馏水，以减少带入化学污染的机会。

如果要添加NaHCO3，要选用纯度高的NaHCO3，最好是经过细胞培
养测试的。

·另外尽量使用一次性的细胞培养器皿。

由于标准厂家一次性细胞培养器皿的生产环境比较严格，得到的产品洁净度很高，从而减少了由细胞培养器皿带入污染的机会。

减少生物污染
由于一般的污染发生在细胞培养的操作过程中，所以良好的细胞培养操作环境和操作习惯是减少生物污染的关键。

要用一个专门的房间用于细胞培养，注意保持房间的清洁。

要有一个定期检验的合格的超净台（超净台内的洁净度应该为100级，与计算机硬盘的生产环境相当）。

在使用超净台前开启通风装置并打开紫外灯灭菌30分钟。

操作时要戴一次性橡胶手套，并喷洒70%酒精消毒。

任何带入超净台的非无菌物件都要喷洒70%酒精消毒。

收集废培养液的瓶子要加入漂白粉或漂白液，以避免微生物的生长。

每次实验完后，要向通向废培养液瓶的塑料管内喷洒70%酒精，并且用蒸馏水和70%酒精先后擦拭台面（只用70%酒精擦拭会导致洒落在台面的培养液在台面上形成难以清除的污垢）。

不要在超净台里使用酒精灯等灯具，因为这样会因灯的热的火焰引起的空气对流而破坏超净台里本来规则的空气层流，使本来存在于超净台底层的微粒被带到上层，带来更多的污染机会。

·加热培养液的37°C恒温水浴中非常容易有微生物的生长，从而成为一个重要的污染源。

所以需要定期清洗恒温水浴。

细胞培养箱内的用于保持湿度的水盘也需要定期清洗。

为了减少不同细胞株间的相互污染，不要用同一瓶培养液或胰酶培养不同的细胞；不要在一个超净台上同时进行多种细胞的操作。

分装每次小量使用的溶液（如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液），以减少多次使用时污染的机会。

以防万一
即使再小心，污染难免还是会发生。

所以得到一个新的细胞株后的第一件事情，是把细胞生长扩增后冻存起来，以备不测。

内毒素是什么？
内毒素的化学成分是脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分之一。

一个活的细菌很少释放内毒素，但死后可放出大量内毒素。

内毒素在血液中存在时会引起动物发热，是医疗注射液中最主要的。

19 世纪40 年代开始用注射溶液引起兔的发热反应实验来检测热原（主要是细菌内毒素）。

后来研究者发现鲎（一种海洋生物）血液遇到极微量的内毒素会发生凝血反应，从而在19 世纪70 年代发明了鲎试剂用于快速精确检测内毒素。

内毒素含量一般用国际单位（EU ）来衡量，一般来说1EU 大致等于0.1-0.2ng。

由于内毒素会对很多种细胞产生刺激，影响实验结果，所以在实验中要尽量减少在培养液中的内毒素的来源。

由于生产工艺的提高，来自标准厂家的血清和培养液中的内毒素含量很少。

所以现代实验室细胞培养中内毒素的来源主要是水、添加剂、细胞培养器皿等。

传统的玻璃仪器制备的双蒸水和通过离子交换柱、活性炭柱和超滤三个环节的纯水制备仪制备的超纯水都能满足细胞培养用水的要求。

盛水器具上的细菌内毒素可能给超纯水带来污染。

长时间放置的超纯水也可因盛水器具上细菌生长而污染细菌内毒素。

内毒素能紧密的粘在玻璃器皿上，实验室里用普通的方法不能完全的消除除内毒素。

用250 ℃，30 分钟或180 ℃，2 小时干热灭菌能完全除掉玻璃器皿上的内毒素。

一次性塑料器皿经过高温注塑成型，没有内毒素存在。

但在处理、包装等生产过程中，可能污染内毒素。

杭州生友生物技术有限公司生产的一次性细胞培养皿和培养板等在万级无尘车间生产和包装，产品的内毒素含量低于0.5EU/ml。

应该选用什么样的抗生素和相应的浓度？
抗生素在五十年代开始细胞培养中得到使用。

它大大减少了细胞培养中细菌等微生物污染的机会，从而使细胞培养在普通实验室就可以轻易操作。

·最常用的抗生素是苄基青霉素钾盐（Penicillin G potassium ）和链霉素硫酸盐（Streptomycin sulphate）的混合液，通称PS。

青霉素抑制细菌细胞壁的合成，链霉素则抑制细菌蛋白质的合成。

一般青霉素的浓度为10,000U/ml, 链霉素的浓度为10,000ug/ml。

青霉素在普通的医院或药店可以买到。

链霉素由于对听觉神经具有损害，已经很少用于医疗，所以需要向专门的化学试剂公司购买。

有一些培养过程污染源比较多，比如组织培养。

为了减少污染，常常需要在培养液中加入其他的抗生素。

比如庆大霉素（Gentamycin sulfate，抑制细菌蛋白质的合成），两性霉素B （amphotericin B，干扰含胆固醇的细胞膜的功能，抑制酵母和真菌的生长，对培养细胞也具有一定的毒性）等。

可用于细胞培养的抗生素种类非常多，如果细胞培养过程比较特殊，污染源比较多，可以考虑选用其他的抗生素。

即使使用多种抗生素的组合，污染还是有可能发生。

所以减少污染的关键，是规范的实验环境和操作。

抗生素的使用，也会使一些污染长期潜伏，同时与五十年代抗生素开始引入细胞培养时相比，现在的过滤技术，超净台的质量等都已经有了很大的提高，在培养过程中带入污染的机会大大减小了，所以有不少人建议在普通的细胞培养过程中不要使用抗生素。

为什么有人提倡细胞培养液中不要加抗生素？
抗生素虽然减少了可以观察到的细菌、酵母等微生物的污染机会，却会增加支原体、病毒等隐性污染的机会。

因为细胞培养中污染主要来源于空气中的微粒和汽雾，而这些微粒和汽雾可以同时携带支原体、病毒和其他微生物。

当抗生素使用时，可见污染被抑制而隐性污染又没被注意到，这样支原体、病毒等隐性污染的机会反而增加了。

Barile的一项研究显示（1），72%持续使用抗生素培养的细胞有支原体污染，而不使用抗生素培养的细胞支原体污染的比例只有7%。

反过来如果不使用抗生素，支原体、病毒的污染往往会伴随细菌和酵母等的污染。

由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，污染细胞的及时清理就大大减少了支原体、病毒的污染机会。

潜在的支原体、病毒的污染会带来很大的危害。

这些微生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者得到错误的实验结果。

在严重的情况下，甚至使一个实验室数年的研究白白浪费。

由于过滤技术的提高和超净台质量的改进，在规范的细胞培养操作过程中引进污染的机会已经被大大降低了。

所以比较合理的建议是，在常规的细胞培养中不要使用抗生素。

只有在培养污染源很多（比如组织培养），或者培养非常珍贵的细胞株时才使用抗生素。

1. Barile, M. F. Mycoplasmal Contamination of Cell Cultures: mycoplasma-Virus-Cell Culture Interactions. in Contamination in Tissue Culture, J. Fogh, ed. (Academic Press, Inc., New York, 1973) 131-171. 38. Perlman, D. Use of Antibiotics in Cell
直接培养法检测细胞培养中的支原体污染
特点: 最直接最灵敏的检测手段。

缺点：培养时间长，需3-5周才能判断。

有些支原体不能在培养基上培养出来（例如M. hyorhinis）。

需要同时培养支原体菌株作阳性对照，可能会造成污染。

材料：葡萄糖、L-盐酸精氨酸、Difco PPLO broth（Difco 0554-17-1）、马血清、15%酵母膏溶液（高压灭菌）、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管（高压灭菌）、无菌培养皿（60x15mm）、玻璃棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应该用无菌水，每次打开厌氧缸后用70%酒精擦拭内壁。

）
培养基准备：基本配方为Difco PPLO broth（60%），马血清（20%），15%酵母膏溶液（10%），10x储存液（10%）。

由于培养时间长，可加50u/ml青霉素至10x储存液或加入乙酸铊（1：2000）至培养基中以防止其他细菌的污染。

10x储存液（1升）：称取50克葡萄糖，10克L-盐酸精氨酸溶于1升蒸馏水中。

用0.22μm 无菌过滤膜过滤除菌，分装100ml至瓶中，-70℃保存。

液体培养基（1升）：称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红于600ml蒸馏水中加热搅拌溶解。

灭菌121℃15分钟灭菌。

待温度降低至室温后于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml 15%酵母膏溶液及100ml解冻的10x储存液，混合均匀后分装至已灭菌的有盖螺旋试管中，10ml/管。

4℃保存，保存期限为1个月。

固体培养基：称取21克Difco PPLO broth，0.02克酚红，15克Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解。

121℃15分钟灭菌，放入50℃水浴中，待温度降至50℃时于无菌超净台内加入200ml马血清，100ml 15%酵母膏溶液及解冻的10x储存液，混合均匀后倒入60x15mm 无菌培养皿中，5ml/皿。

保存于4℃，期限为1个月。

步骤：取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液接种于液体培养基中，置于37℃培养2周，观察是否有浑浊或pH变化。

培养一周及两周后，分别取0.1ml液体培养液涂于琼脂平板上，倒置于厌氧缸中，37℃培养至少3周，持续观察是否有支原体菌落出现。

另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液涂于琼脂平板上，37℃厌氧培养3周，持续观察是否有支原体菌落出现。

另作正负对照组，正对照为Acholeplasma laidlawii（A TCC 23206）与M. arginini（A TCC 23838）。

负对照组为待测细胞的新鲜培养液。

结果判断：支原体生长较慢，所以先在液体培养基中培养1-2周增殖后再培养于琼脂平板上，至少培养3周后才能断定是否有支原体污染。

所以总个测试要5周才知道正确结果。

典型的支原体菌落是荷包蛋形，是由于支原体网琼脂下层生长所致，为无色透明菌落，大小约为10-55μm 。

但是并非所有支原体都是荷包蛋菌落，有些是圆形或类似黏菌类形态。

区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自琼脂平板上切下，重新培养于液体培养基中，培养一周后再接种入琼脂平板，细胞和菌落则不会生长。

本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库
原理：利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）检测支原体污染。

这种染料会结合到DNA的A-T福集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可将其染色而检测。

被支原体污染的细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体污染。

特点:简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行的检测手段。

可以检测?快，约一周既可知道结果。

缺点：有时会有背景荧光，影响结果判断。

材料：Hank''s balanced salt solution （不含NaHCO3 和酚红，HBSS，GibcoBRL 21250-014）、二苯并噻唑（bisbenzimide，Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M柠檬酸、0.2M磷酸氢二钠、甘油、冰醋酸、甲醇、无菌水、chamber slide（Nunc 177380）或其替代物：35或60mm细胞培养皿内放无菌22x22mm盖玻片（浸于酒精中用前过火灭菌），染色后取出盖玻片细胞面朝下放玻片上观察。

指示细胞：Vero（ATCC CCL-81或CCRC60013）或3T6（ATCC CCL-96或CCRC60070），细胞须先测试无污染。

MEM，10%FBS（Vero的培养液）。

试剂准备：无菌HBSS：配置Hank''s balanced salt solution，用0.22um无菌滤膜过滤除菌。

Hoechst 33258 储存液（100x）：称取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml 无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml/支分装到1.5ml小离心管中，-20℃保存。

Hoechst 33258 工作液：取1ml储存液加入100ml无菌HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以锡箔纸包裹，避广光保存于4℃。

封固溶液（mounting solution）：22.2ml0.2M 柠檬酸和27.8ml0.2M Na2HPO4加入50ml 甘油中，用1N NaOH调pH至5.5（pH很重要），4℃保存。

固定液：冰醋酸：甲醇=1：3（v：v），用前配置。

步骤：
1.培养Vero细胞：Vero细胞可作长期培养或制作多个冻存管，测试前解冻培养。

测试前一周培养Vero细胞。

2.在接种待测样品前一日，将Vero细胞以1-2x104细胞/ml培养于chamber slide中，每孔加入1ml细胞悬浮液，于37℃，5%CO2培养。

隔日确定生长良好后即可接种待测样品细胞。

3.接种待测样品：样品种类：1ml待测的培养基，1ml待测的细胞培养液（可刮下少许细胞）0.05-0.1ml 冷冻管的细胞悬浮液。

4.将待测样品加入chamber slide内培养5天后，进行Hoechst 33258的荧光染色观察。

5.以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染V ero细胞作阳性对照，阴性对照用Vero 细胞的新鲜培养基（MEM +10%FBS）。

DNA荧光染色检测：
6.取出培养5天的Vero细胞，吸除培养液。

每孔加2ml固定液，静置十分钟后吸除固定液，重复一次，风干10分钟。

7.每孔加入1mlHoechst 33258 工作液，室温下静置30分钟。

8.吸掉Hoeshst 33258染液后，用无菌水洗涤3次，风干后加入1滴封固溶液，并以盖玻片盖之。

9.用100-400x荧光显微镜观察。

打开汞灯10分钟后，用UV激发光（330-380nm）的滤光镜，观察细胞核外是否有兰色荧光小点或丝状点的荧光。

结果判断：如有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现兰色荧光小点或丝状点。

其形状一致，与细胞残片染成的不规则点状物不同。

其荧光可维持数周。

本文内容主要来自台湾国家卫生研究院细胞库
PCR法测细胞培养的支原体污染
原理：利用特殊专一性的引物，经PCR反应来复制支原体DNA。

所用的引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定。

特点：灵敏及快速，可检测到不易培养的支原体，不必培养支原体作阴阳性对照，避免可能带来的污染。

缺点：PCR反应很灵敏，容易带来假阳性结果，仅能作为参考。

材料与设备：A TCC支原体检测试剂盒（可作50-100个反应，提供第一阶段引物混合物与第二阶段引物混合物，有DNA阳性对照(A. laidlawii, M. pirum)），PCR反应试剂（Taq 聚合酶，dNTP，10xPCR buffer，25mM 氯化镁，PCR水），PCR仪，琼脂糖胶电泳设备，手套，无菌PCR反应管，无菌1.5ml微量离心管，无菌2ul、20ul、200ul、1000ul枪头。

引物序列：
第一阶段引物混合物：1. ACACCA TGGGAG（C/T）TGGTAA T，2. CTTC（A/T）TCGACTT （C/T）CAGACCCAAGGCA T， 3. AAAGTGGGCAATACCCACGC， 4. TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG
第二阶段引物混合物：1. GTG（C/G）GG（A/C）TGGATCACCTCCT，2. GCATCCACCA （A/T）A（A/T）AC（C/T）CTT，3. CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT
操作过程：
12. 第一阶段的PCR反应：加样品2ul（直接取待测细胞培养液、支.5ul，第一阶段引物混合物0.5ul，dNTP（1.25mM each）1.0ul，氯化镁（25mM）0.5ul，Taq DNA 聚合酶（5U/ul）0.1ul，PCR水18.4ul至PCR管，混匀，放入PCR仪反应。

13. PCR 反应（第一阶段与第二阶段同）：94℃变性（30秒），94℃（30秒）、55℃（2分钟）、72℃（2分）30循环，72℃延伸（5分钟），4℃保存
14. 第二阶段PCR反应：加样品1ul（第一阶段产物），10x buffer（含1.5mM氯化镁）2.5ul，第一阶段引物混合物0.5ul，dNTP（1.25mM each）1.0ul，氯化镁（25mM）0.5ul，Taq DNA 聚合酶（5U/ul）0.1ul，PCR水19.4ul至PCR管，混匀，放入PCR仪反应，反应程序同2。

15.琼脂糖凝胶电泳：2.0%琼脂糖凝胶（含EB），1xTAE电泳缓冲液，选择100-500bp DNA marker，第二阶段反应产物各取10ul加入2ul loading dye（6x），电泳分离（100V，25分钟），。