细胞器分离

（2）线粒体：取步骤(3)中，上清液和沉淀物悬液 分别做涂片C和D，马上各滴1滴1%詹纳氏绿B染液 染色20分钟，盖上盖玻片镜检观察。
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『作业』
绘图：A,B,C,D载玻片上观察到的细胞器（标 注所拍摄到的细胞器类型，注明放大倍数， 做好必要的标注）
（4）普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟，缓缓吸 取上清液，移入eppendorf管中，放在有冰块的器皿中，等 分离线粒体时用（直接进入第二大步）。同时制一张上清 液涂片A，做好记号，自然干燥。
（5）用8ml离心介质悬浮沉淀物，用吸管混匀，以2500r/min 的速度离心15分钟，吸弃上清液，沉淀物加入0.5ml离心介 质，用吸管充分吹打成悬液，制备1张涂片B，做好标记， 自然干燥。
『实验原理』 利用各种物理方法如研磨、超声振荡和低渗等将
组织制成匀浆，细胞中的各种亚组分即可从细胞中释 放出来。由于细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密 度不同，可以利用不同的离心方法进行分离，通过组 织匀浆、分级分离和分析三步完成。
分离的方法主要有差速离心和密度梯度离心两种。
差速离心法：由低速到高速逐级沉淀分离，使较大的 颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮 于上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚 细胞组分得以分离，必须反复悬浮和离心加以纯化。
（3）将上清液吸入另一eppendorf管中，留存沉淀物中加0.1ml 的匀浆介质混匀成悬液（沉淀充分吹散）。eppendorf管同时 置于冰浴中，待制片时鉴定用。
3、分离物鉴定
（1）细胞核：将涂片A、B浸入甲醇-冰醋酸液中固 定15分钟，充分吹干，滴姬母萨染液染色10分钟。 自来水冲洗，吹干，镜检。
2、高速离心分离提取线粒体
（1）将装有上清液的eppendorf管取出平衡，在冷冻高速离心机 上以15000r/min离心20分钟，缓缓吸去上清液，留取沉淀物。 如沉淀的表面有1层浅色的疏松层时，则应连同上清液一起小 心吸去。
（2）沉淀再加入预冷离心介质悬浮，用tip头吹打后再以 15000r/min离心20分钟。
离心场的离心力常用重力加速度g（9.8 m/s2）的倍 数来表示，而实际操作时人们习惯用r/min（离心机转
子每分钟旋转的圆周数）来掌握。两者关系如下：
离心力g=1.11×10-5n2r
注：r为离心机中轴到离心机远端的距离，n为离心机 每分钟的转速（r/min）
『实验内容和方法』
1、低速分离细胞核
差速离心法逐级分离出各个细胞器
低速离心
中速离心
高速离心
超速离心
大颗粒 中颗粒 小颗粒
不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离：普 通离心机（8000r/min）可分离直径大于1µm的生物颗 粒；高速离心机（8000-25000r/min）可分离直径为 0.1-10µm的生物颗粒；超速离心机（25000-80000 r/min）可分离直径为3.2-100nm的生物颗粒和生物大 分子。为了限制和保持细胞亚组分内酶的生物活性， 有的离心机还装有低温控制装置（0-4℃）。
（1） 将小鼠杀死，取出肝脏，剪成数小块，用预冷的生理 盐水反复洗涤除去血污，用滤纸吸干表面的水分。
（2）称取肝组织1g，取8ml预冷的匀浆介质，先加入少量于 小烧杯中，尽量剪碎肝组织，再将剩余的预冷匀浆介质加 入其中。
（3）匀浆，用3-4层纱布（先用少量匀浆介质润湿）过滤匀 浆介质至离心管中(可先过滤至皿中)，离心管内匀浆液为 6-8ml。