实验二 细胞器的分离与提纯

实验二细胞器的分离与观察

一、教学目的与要求

1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。

2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。

二、实验原理

线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。

制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。

悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。

线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。

三、实验用品

器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。

材料：新鲜的猪肝脏。

试剂：见PAGE 64

四、实验步骤

1. 制备猪肝细胞匀浆。实验前购买新鲜猪肝脏备用。

割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。

2. 差速离心。先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml 肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。

3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。

4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。

5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。

5. 分离物鉴定。

①细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，加甲醇-冰醋酸液1滴固定15min，充分吹干，滴1滴姬姆萨染液染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。

②线粒体：取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染色20min，覆上盖玻片，镜检。线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。

取猪肝2g

用预冷的0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤3次，

研磨成匀浆

匀浆液

多层纱布过滤，

700×g 离心10min

沉淀上清液

10000×g离心

10min 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次

每次1000×g离心15min 沉淀（线粒体）

沉淀洗涤

（细胞核及质膜碎片） 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次,

每次10000×g离心15min

镜检

沉淀

镜检

五、作业

1、根据镜检结果，绘制线粒体结构简图。

2、分离得到的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后染色，两者着色有何不同。