实验二 细胞器的分离与提纯
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
【新教材生物一轮复习】必修1 第2单元 第2讲 细胞器之间的分工合作
类和包装 的“车间”及“发送站”。
4．④内质网：蛋白质等大分子物质的合成、加工场所和运输通 道__。
5．⑤液泡：内有细胞液，调节植物细胞内的环境，充盈的液泡 还可以使植物细胞保持坚挺，主要存在于植物细胞中。
6．⑥溶酶体：细胞内的“消化车间”，内部含有多种水解酶， 能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死 侵入细胞的病菌或病毒。
细胞结构中的“一定”与“不一定” (1)具有细胞壁的细胞不一定是植物细胞，如真菌、细菌等都有 细胞壁(注意细胞壁的组成成分不同)。 (2)能进行光合作用的生物，不一定有叶绿体(如蓝细菌)，能进行 有氧呼吸的生物不一定有线粒体(如好氧细菌)。
(3)蛋白质合成场所一定是核糖体，核糖体的形成不一定都与核仁 有关(如原核细胞没有核仁，但有核糖体)。
的选择透过性。
( ×)
提示：依赖于生物膜的流动性。
4．生物膜之间通过囊泡运输依赖膜的流动性且不消耗能量。 ( ×)
提示：囊泡运输消耗能量。
5．分泌蛋白先经过高尔基体再经过内质网分泌到细胞外。 ( ×)
提示：分泌蛋白先经过内质网，再经过高尔基体分泌到细胞外。
6．CO2 的固定、水的光解、蛋白质的加工均在生物膜上进行。 ( ×)
C [a 为线粒体，NADH 与氧结合形成水是有氧呼吸第三阶段， 该反应发生在线粒体内膜上，线粒体内膜折叠形成嵴，A 正确；b 为 叶绿体，直接参与光合作用的膜是类囊体薄膜，膜上有光合色素， 发生光反应，B 正确；与光合作用有关的酶没有分布在叶绿体内膜上， C 错误；线粒体中发生化学能转化成热能，叶绿体发生光能转化成 化学能，两者可共存于同一个细胞中，D 正确。]
高中生物--细胞器习题(带答案)
判断正误并找到课本原文1．细胞质基质呈溶胶状，是代谢的主要场所。
( )2．分离细胞器的方法——差速离心法。
( )3．线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞的“动力车间”。
( )4．叶绿体是绿色植物所有细胞含有的细胞器。
( )5．液泡可以调节植物细胞内的环境、充盈的液泡还可以使植物细胞保持坚挺。
( ) 6．内质网是蛋白质等大分子物质的合成、加工场所和运输通道。
( )7．溶酶体是细胞的“消化车间”，内部含有多种水解酶，能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或细菌。
( )8．细胞骨架是由蛋白质纤维组成的网架结构，与细胞运动、分裂、分化及物质运输、能量转化、信息传递等生命活动密切相关。
( )9．观察叶绿体时可选取菠菜叶稍带些叶肉的上表皮细胞。
( )10．研究分泌蛋白合成和运输的方法是同位素标记法。
( )11．在分泌蛋白的合成、加工、运输的过程中，需要消耗的能量全部来自线粒体。
( ) 12．在分泌蛋白合成、加工、运输过程中，高尔基体起着重要的交通枢纽作用。
( ) 13．生物膜的组成成分和结构相似，在结构和功能上紧密联系。
( )14．生物膜把各种细胞器分隔开，使细胞内能同时进行多种化学反应，而不会互相干扰。
( )细胞可以清除功能异常的线粒体，线粒体也可以不断地分裂和融合，以维持细胞内线粒体的稳态。
下列有关线粒体的叙述，错误的是()A．线粒体具有双层膜结构，内、外膜上所含酶种类相同B．线粒体是真核细胞的“动力车间”，为细胞生命活动提供能量C．细胞可通过溶酶体清除功能异常的线粒体D．细胞内的线粒体数量处于动态变化中易错判断1．哺乳动物红细胞、蛔虫、原核生物因为没有线粒体，所以不能进行有氧呼吸。
() 2．蓝细菌、光合细菌无叶绿体也能进行光合作用。
()3．植物细胞不一定都有叶绿体，如根尖细胞。
()4．脂质(如性激素)的合成场所：内质网。
()5．液泡是最大的细胞器，且液泡里的色素种类与叶绿体一致。
()6．线粒体、叶绿体、溶酶体内存在核糖体。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
细胞器的分离与观察
4.14沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次1000g（3900r/min）离心10min；
4.15纯化：将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后用注射器加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL，1500g（4800r/min）离心15—20min；
4.16用PBS溶液悬浮——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色20-30min——丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检；
2.实验原理、试验流程或装置示意图
2.1新鲜取出的小鼠肝脏为组织块，为了得到细胞核和线粒体，首先需要进行匀浆，将细胞从组织块中分离出来，然后再经过进一步匀浆，使细胞膜破碎，细胞解体，各种细胞器被分离出来；同时，0.25mol/L蔗糖溶液，使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底；
4.实验方法步骤及注意事项
4.1实验方法步骤：
4.11称取0.5g小鼠肝脏置于小烧杯中，用解剖剪将其剪碎，然后用生理盐水清洗数次，最后用0.25mol/L的蔗糖溶液清洗一次；
4.12将清洗好的小鼠肝脏置于玻璃匀浆器中加入1.5ml0.25mol/L的蔗糖溶液即可进行细胞匀浆，待其充分匀浆后备用；
4.13取1.5ml匀浆置离心管中，600g（3000r/min）离心10min，上清液留作线粒体分离；
叶绿体的分离、纯化和鉴定.pdf
(2)细胞破碎时，不必过细。用普通的家用食品 料理机匀浆2 min同样可以达到很好的效果。此 外，过滤时不要用力挤压，以避免对叶绿体被膜 的破碎。在用细胞器分离缓冲液悬浮叶绿体粗提 物时应轻缓，在冰上轻轻晃动使叶绿体分散开来。
心机配平)， 轻轻吸取上清液。 5. 在2.0ml离心管内依次加入50%蔗糖溶液0.9ml和15%蔗糖溶液 0.5ml（注意15%蔗糖溶液要缓缓沿离心管壁注入，不能搅动 50%蔗糖液面）。 6. 小心地沿离心管壁加入0.4ml上清液。 7. 离心8000r/min, 20 min。 8. 取出离心管，可见叶绿体在密度梯度 液中间形成带。
冲液 ph=7.4） 50%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液，0.01%吖啶橙
Байду номын сангаас
实验步骤
1.选取菠菜叶片（选择嫩绿色的新鲜叶片），洗净擦干后去除 叶梗和粗脉，撕成小碎块（剪碎更宜碾磨），称2~3g放于玻 璃匀浆器中
2.加入预冷（放在冰上预冷）到0℃匀浆介质10ml，在冰上用研 钵研磨。
3.捣碎液用尼龙网过滤于50ml烧杯中。 4.将滤液平分到2个离心管中（2ml），1000r/min下离心1min(离
(4)加样时一定要小心，防止破坏梯度。为此，应采用宽口 吸头吸取叶绿体粗提物悬浮液，释放时，将枪头贴于管壁 接近15％蔗糖浓度处缓慢释放。
(5)离心时，为防止速度快速上升和快速下降对浓度梯度层 的破坏，离心机的加速一定要缓慢，而下降时也要缓慢停 下。此外，为防止高速离心过程中温度上升可能造成的由 于颗粒扩散而引起的梯度破坏，离心前一定要让离心机在 0℃或更低的温度下充分预冷【1】。
9.用吸管对准叶绿体那一层吸取一滴叶绿体悬液滴于载片上， 加盖片观察： 1）在普通光镜下观察；
植物分离提纯实验报告
植物分离提纯实验报告引言植物分离提纯实验是一种常见的分析植物中活性成分的方法。
通过分离和纯化，可以获得高纯度的植物成分，进而进行进一步的结构鉴定和药理学研究。
本实验旨在通过提取、分离和纯化的方法，获得植物中的目标成分。
实验方法材料准备- 实验材料：植物样品（本次实验选用了蒲公英叶片），甲醇、乙醚、石油醚、氯仿、浓盐水、浓硝酸、无水钠硫酸、醚石等。
- 实验设备：量筒、均质器、漏斗、玻璃棒、试管、烧杯、离心机、显微镜、旋转蒸发仪等。
提取植物成分1. 收集新鲜的蒲公英叶片，彻底清洗并晾干。
2. 将蒲公英叶片粉碎，加入甲醇浸泡24小时，提取目标成分。
3. 使用均质器将叶片浸取的甲醇悬浮液进行均质处理。
4. 将混合物过滤，得到植物成分的甲醇提取物。
分离植物成分1. 将提取物转移到漏斗中，加入等体积的氯仿。
2. 加入适量的盐水，轻轻摇动漏斗，使两相分离。
3. 用玻璃棒搅拌植物中的非极性物质，与氯仿相溶。
4. 分离氯仿相得到目标非极性成分溶液。
纯化植物成分1. 取得目标成分溶液。
2. 加入等体积的乙醚并搅拌均匀，使其析出沉淀。
3. 将混合物离心，得到纯度较高的目标成分固体。
4. 通过旋转蒸发仪去除残留的有机溶剂，得到目标成分的纯化物。
结果与讨论在本次实验中，我们通过提取、分离和纯化的方法，成功获得蒲公英叶片中的目标非极性成分。
在提取过程中，甲醇作为有机溶剂可以较好地提取植物中的成分。
分离过程中的氯仿相对于目标成分具有较好的极性，使得目标成分独立于其他成分。
通过加入乙醚并进行旋转蒸发，我们获得了纯度较高的目标成分。
经过显微镜观察，我们发现提取物中含有大量的植物细胞和细胞器。
而经过分离和纯化后，目标成分固体呈现出白色结晶的形态，研究证明其为植物的次生代谢物，可能对该植物具有重要的药理活性。
然而，在本次实验中，我们只能通过形态观察获得目标成分的初步信息，还无法确定其化学结构和药理学特性。
进一步的研究还需依赖其他分析方法，如质谱分析和核磁共振等。
植物细胞分离实验报告
一、实验目的1. 熟悉植物细胞分离实验的基本原理和方法。
2. 掌握植物细胞器分离纯化的操作技能。
3. 了解不同细胞器在分离过程中的沉降特性。
二、实验原理植物细胞分离实验是细胞生物学和分子生物学研究的重要技术之一。
通过采用差速离心和密度梯度离心等方法，可以将植物细胞中的各种细胞器分离纯化，从而研究其结构和功能。
本实验采用差速离心法分离植物细胞中的线粒体和叶绿体。
三、实验用品1. 植物材料：洋葱鳞片叶或菠菜叶片。
2. 实验试剂：生理盐水、蔗糖、盐酸、缓冲液、龙胆紫染液。
3. 实验仪器：离心机、匀浆器、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子、培养皿、铅笔。
四、实验步骤1. 细胞破碎：将植物材料放入匀浆器中，加入适量生理盐水，高速匀浆，破碎细胞。
2. 差速离心：将匀浆液转移至离心管中，以3000r/min的速度离心10分钟，分离出细胞碎片。
3. 叶绿体分离：将离心后的上清液转移至新的离心管中，以5000r/min的速度离心10分钟，分离出叶绿体。
4. 线粒体分离：将离心后的沉淀物重新悬浮于生理盐水中，以12000r/min的速度离心15分钟，分离出线粒体。
5. 染色：将分离出的线粒体和叶绿体分别加入适量龙胆紫染液，染色5分钟。
6. 观察：将染色后的线粒体和叶绿体分别滴在载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察。
五、实验结果1. 叶绿体：呈绿色，呈球形或椭球形，细胞器较大，直径约2-4微米。
2. 线粒体：呈蓝色，呈杆状或圆形，细胞器较小，直径约0.5-1微米。
六、实验讨论1. 在差速离心过程中，不同细胞器的沉降速度不同，因此可以通过调整离心速度和时间，实现细胞器的分离纯化。
2. 本实验中，叶绿体和线粒体的分离效果较好，说明差速离心法适用于植物细胞器的分离。
3. 实验过程中，要注意控制匀浆时间和离心速度，以免影响细胞器的结构和功能。
七、实验结论本实验成功分离出植物细胞中的叶绿体和线粒体，并通过显微镜观察了其形态特征。
2023新教材高中生物第3章细胞的基本结构第2节细胞器之间的分工合作Ⅰ课堂互动探究案新人教版必修1
第2节细胞器之间的分工合作(Ⅰ)课程标准阐明细胞内具有多个相对独立的结构，担负着物质运输、合成与分解、能量转化和信息传递等生命活动。
素养达成设疑激趣C919飞机是我国研制的新一代大型客机。
研制C919飞机需要若干部门分工合作，如整体研发设计、特种材料及工艺技术、机载系统研发、总装制造等部门。
细胞内也存在类似的部门或车间吗？你能举出例子吗？细胞内各种不同的细胞器类似不同的生产车间，大家分工合作共同完成细胞的相关生命活动。
本节课我们共同学习细胞器。
夯基提能·分层突破——互动·探究·智涂探究点一各种细胞器的结构和功能1.细胞在生命活动中发生着物质和能量的复杂变化，其内部就像一个繁忙的工厂。
阅读教材，结合材料思考：(1)如果把细胞看作一个鱼缸的话，缸体就是细胞膜，里面的水(代表着________)和各种鱼(代表着________)就构成了细胞质。
(2)绿色植物所有的细胞中都有叶绿体吗？举例说明。
(3)叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，没有叶绿体的细胞是否一定不能进行光合作用？(4)线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所。
那么，进行有氧呼吸的细胞一定有线粒体吗？(5)心肌细胞中线粒体数量显著多于腹肌细胞的，为什么？2．如图是某种生物的细胞亚显微结构示意图，试据图回答下列问题：(1)该细胞是哪种细胞？说明判断的理由。
(2)图中[1]和[2]的主要成分分别是什么？与[2]形成有关的细胞器是哪种？(3)若该细胞是西瓜的红色果肉细胞，则色素存在于哪种细胞器？(4)若该细胞是洋葱的根尖细胞，则图中不应该具有哪种细胞器？(5)光合作用和细胞呼吸的主要场所分别是图中的哪个细胞器？它们有什么共同点？[归纳总结]巧记细胞器[易错提醒]关于细胞器的三点提醒(1)低等植物(如衣藻等)既含有叶绿体，也含有中心体，所以它们的细胞器种类最全，故不能认为含有中心体的一定是动物细胞。
(2)据分布位置不同，核糖体有两类：一类是附着在内质网上的核糖体，一类是游离的核糖体。
细胞核的分离与鉴定
细胞分化与发育
细胞核内的基因表达在不同细 胞类型和发育阶段中具有特异 性，对细胞的分化与发育起着 关键作用。
疾病发生与发展
许多疾病的发生和发展与细胞 核内的基因变异和异常表达密 切相关，因此对细胞核的研究 有助于疾病的诊断和治疗。
02
细胞核的分离
细胞核分离的方法
差速离心法
利用不同转速离心，将细胞内不同组分进行分离。
100%
核膜和核孔
细胞核具有核膜和核孔，核膜是 细胞核的边界，核孔则是核内外 物质交换的通道。
80%
染色质和核仁
染色质是DNA和蛋白质的复合物， 呈细丝状，而核仁则是染色质较为 密集的区域，与某种RNA（rRNA） 的合成有关。
细胞核的染色和观察
染色原理
染色是通过化学反应将细胞核 中的DNA或蛋白质着色，以便 在显微镜下观察。
方差分析
通过方差分析方法，比较不同处理组之间的差异， 以确定实验因素对细胞核分离效果的影响。
3
相关性和回归分析
通过相关性和回归分析方法，探讨细胞核形态特 征与染色质状态之间的关系，以及其对细胞分裂 的影响。
05
结论
研究成果总结
成功分离出细胞核
01
通过优化实验条件，我们成功地从不同类型的细胞中分离出了
细胞核的分离与鉴定
目
CONTENCT
录
• 引言 • 细胞核的分离 • 细胞核的鉴定 • 实验结果和数据分析 • 结论
01
引言
目的和背景
目的
细胞核是细胞内最重要的细胞器之一，负责储存遗传物质、转录 和翻译等重要功能。对细胞核的分离与鉴定有助于深入了解细胞 核的结构和功能，为研究细胞生物学、遗传学和疾病机制提供重 要基础。
人教(2019)生物高考复习：第6讲 细胞器之间的分工合作
(4)有中心体的生物不一定为动物，但一定不是高等植物。 (5)高尔基体经囊泡分泌的物质不一定为分泌蛋白(神经递质、激素 等)，但分泌蛋白一定经高尔基体分泌。 (6)具有细胞壁的细胞不一定是植物细胞，真菌、细菌也都有细胞壁。 (7)没有叶绿体和中央液泡的细胞不一定是动物细胞，如根尖分生区 细胞。
[考向预测]
【答案】D 【解析】分析题图：Ⅰ含有中心体，不含细胞壁，属于动物细胞； Ⅱ不含中心体，含有叶绿体、液泡和细胞壁，属于高等植物细胞；Ⅲ是 原核生物中的蓝细菌细胞；Ⅳ含有中心体和细胞壁，属于低等植物细胞。 图中结构①～⑥依次是内质网、线粒体、中心体、叶绿体、液泡和高尔 基体。
图中只有Ⅲ无染色体，属于细胞生物中的原核生物，其遗传物质就 是DNA，同种生物的遗传物质无主次之分；核糖体没有膜结构；Ⅰ、Ⅱ、 Ⅳ中的②结构表示线粒体，葡萄糖首先在细胞质基质中分解成丙酮酸才 能进入线粒体中进一步分解，即线粒体不能直接氧化葡萄糖；含有色素 的细胞器是⑤液泡和④叶绿体，细胞Ⅱ高度分化，不进行分裂，因此无 法观察到染色体。
3．8种常见细胞器的结构及功能
(1)①__线__粒__体____：进行__有__氧__呼__吸__的主要场所，是细胞的“动力车 间”。
(2)②___叶__绿__体___：能进行光合作用的植物细胞所特有，是“养料制 造车间”和“能量转换站”。
(3)③___高__尔__基__体_____ ： 主 要 是 对 来 自 内 质 网 的 蛋 白 质 进 行 __加__工__、__分__类__和__包__装____的“车间”及“发送站”。在植物细胞中与细胞 壁的形成有关。
3．各种膜结构增大膜面积的方式
4．分泌蛋白的加工和运输过程中膜面积变化图 (1)图1和图2都表示膜面积随时间的变化，图1表示分泌前后两个时 间点的变化，图2表示一定时间段内相关结构膜面积的变化。 (2)图1和图2分别以直方图和曲线图的形式表示在分泌蛋白加工和运 输过程中，内质网膜面积减小，高尔基体膜面积基本不变，细胞膜面积 相对增大的现象。
细胞和细胞器及间质的分离
第三章细胞和细胞器及间质的分离细胞内各种结构的比重、大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，所以常用不同介质、不同转速、不同时间，通过分级离心，将细胞内各种结构组分（细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等）分离出来。
主要方法是：组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。
一、细胞的分离根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。
其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例，也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例，假设细胞为球形，则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示V= 2g(ρc–ρs)r²9η遵循Stokes定律，其中：ρc和ρs分别是细胞和溶液的密度，η为溶液粘度，r为细胞半径，g为重力加速度。
根据细胞直径（大小）的分离方法：主要是速度下降。
细胞在单位引力下，通过低密度介质，或在低离心力作用下，通过密度梯度沉降。
由于细胞大小不同，沉降速度不同，细胞越大沉降越快。
根据细胞密度分离是等密度分离，就是细胞在连续密度梯度分离介质中，在强离心作用下，细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面，并能保持平衡，在非连续密度梯度中，分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上，从而达到分离。
操作方法：（一）单位重力沉降法：分离介质主要是牛血清白蛋白，其分离的细胞活性高、费用也昂贵。
现已用蔗糖替代，仍能取得较好的分离效果。
1．在固定沉降池上方加入30ml PBS/BSA，含有细胞1×108于池底。
2．从池周边加入50ml PBS覆盖于样品上，不要使整个界面破坏。
3．下口接1％蔗糖梯度液，稍松下口，缓慢放入50ml 1%蔗糖梯度液，约10ml/min。
4．接通梯度混合仪，从下口加入1200ml 1~2%蔗糖梯度液，速度为50ml/min。
5．最后加入500ml 2.5%蔗糖梯度液。
6．整个沉降系统，于4℃，静置4h，这时细胞按大小先后沉降，未成熟的红细胞在先，成熟的网织红细胞在最后。
实验 细胞器的分离
• ①、②、③片，自然干燥后，放入Giemsa染 液缸中染色 5min，用蒸馏水洗去染液，镜检。 • ④片先滴 1—2 滴健那绿 B 于玻片上，挑少许 沉淀在染液中混匀，染5min，加盖片镜检。
• ⑤片先滴 1—2 滴健那绿 B 于玻片上，滴一滴 上清液在染液中混匀，染 5min，加盖组织； 2.过滤匀浆液的纱布事先用预冷蔗糖液 浸湿； 3.收集液体要避免吸到脂肪层； 4.标记玻片。
三、实验步骤:
蛙肝 ↓冷生理盐水10ml洗，吸干水分，放在小烧杯中 ↓加入预冷蔗糖液(少于9ml)，剪碎 匀浆
↓纱布过滤至15ml离心管，溶液体积14ml。
滤液→做涂片①
↓2000 rpm离心10 min
沉淀 上清液 →做涂片② ↓加预冷蔗糖液至10ml，吹打均匀 ↓5ml,11000 rpm离心10 min，弃上清液 混合液 沉淀 ↓2000 rpm离心10 min，弃上清液 ↓加2ml预冷蔗糖液，吹打均匀 沉淀 混合液 ↓加1ml蔗糖液，混匀 ↓11000 rpm离心10 min 做涂片③ 沉淀 上清液 ↓ ↓ 取少许于载片, 取1滴于载片 加健那绿B 混匀④ 加健那绿B 混匀⑤
实验报告：
1.绘制1-5号涂片镜下形态图；
2.分析比较不同涂片间结果的差异及原因。
用另一玻片轻触液滴前端
载玻片
约1/4处，滴加液滴
图示：涂片制作过程
实验六 细胞器的分离: 细胞核与线粒体的分级分离
一、实验目的
1. 了解用差速离心的方法分级分离细胞组分 的原理和过程。 2. 熟悉离心机、匀浆器的使用方法。
二、实验原理
差速离心：根据被分离物质的体积差异，逐渐提高离心 速度以分离大小不同的细胞器的方法。体积大的沉降快， 反之，则慢。
实验二 鼠肝细胞核及线粒体提取和显微观察
实验二线粒体差速离心法分离技术细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心方法，可将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)是在低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖-0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取。
[实验要求]1．了解并掌握差速离心法分离技术及原理。
2．熟悉线粒体的Janus green B染色方法，并做出分析。
[实验原理]差速分离由低速到高速离心使细胞内各种组分逐渐沉降。
先用低速离心使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心才能不断纯化。
詹纳斯绿(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜。
詹纳斯绿解离后带有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上。
内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色。
詹纳斯绿B也可对活细胞进行染色，在显微镜下可观察到细胞内的线粒体因具有细胞色素氧化酶系统，它可使染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在细胞质中的染料被还原呈无色。
多肽与蛋白质的提取与分离
关键词：多肽蛋白质提取分离摘要：多肽是由多个氨基酸缩合形成的，蛋白质是由几十到几千个氨基酸分子借助肽键和二硫键相互连接的多肽链，随肽数目，氨基酸组成及排列顺序不同，蛋白质分子呈现三维空间结构，并且有生物活性。
采取何种分离方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。
对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。
这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。
㈠﹑多肽的提取与分离多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。
生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。
随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。
相1.高效液色谱（HPLC）HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其他化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。
因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。
如赵骏①等以酪蛋白为原料，采用微生物蛋白酶A水解，其酶解产物为血管紧张素转化酶（ACE）。
2.反相高效液相色谱（RP-HPLC）.用反相色谱法分离多肽和蛋白质的原理是基于蛋白质的疏水性，在不同介质条件下，使不同的蛋白质得以分离，具有快速高效和高回收的特点，在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性。
吴亚丽②等利用反相高效液相色谱法分析降血压肽AHP的最佳工艺条件。
3.疏水作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)HIC是利用多肽中含有疏水基团，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-HPLC具有较少使多肽变性的特点。
细胞膜和细胞器的分离提纯方法（附图）
细胞膜和细胞器的分离提纯方法细胞中的膜结构是整个细胞及多种细胞器的界膜，对于保持细胞和细胞器的独立性是必不可少的，同时很多重要的功能是在膜结构上完成的。
为了研究细胞膜和细胞器的结构与功能，首先要分离出形态与结构完整的、具有生物活性的、纯度高的样品。
在研究工作中，分离细胞膜和细胞器可以用以下方法。
首先是制备一定量的细胞，细胞的来源可以是培养细胞，也可以是某种组织。
培养细胞的收集相对简单一些，直接用胰酶将细胞从培养瓶上消化下来，制成细胞悬浮液。
比较易碎的组织细胞的收集如肝、脾等，可采用匀浆的方法，稍加研磨就可制成细胞悬液。
有些结缔组织，直接研磨不易分离出细胞，可先用适量的胶原酶处理。
细胞制备出来后，进行匀浆处理。
匀浆的方法有多种，如用高速打碎机破碎，低渗，玻璃珠与细胞共振荡，冻融法，超声波打碎等。
可根据实验需要和实验室条件来选择。
无论选择哪种方法，都要尽可能保持膜的完整性。
整个操作过程要避免过于激烈，pH、离子强度和渗透压等条件要适中，一般常用中性和等渗溶液。
匀浆产生的细胞裂解物，可通过一系列差速离心再加上一个梯度离心来分离细胞膜与细胞器，梯度是根据细胞器的大小、密度和沉降特性来设计的。
匀浆分步分离的第一步是差速离心，在一系列的离心过程中离心力逐渐加大，并且将细胞器加入到具有密度梯度的介质中离心，常用的分离介质有蔗糖、甘油、葡聚糖等。
由于每种细胞器的大小和沉降特性不同，因此可被分离出来。
如果只是分离细胞中的某种细胞器，可直接根据那种细胞器所对应的相对离心力，在细胞匀浆后进行离心分离。
哺乳动物红细胞的结构比较简单，其细胞膜可用低渗离心的方法分离出来。
如果是独特的细胞膜，可根据表面电荷的密度采用电泳的方法分离，也可根据大小采用凝胶过滤的方法分离。
（摘自人教版生物1分子与细胞必修教师教学用书，图引自《基础生命科学》高等教育出版社）。
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实验二细胞器的分离与观察
一、教学目的与要求
1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。
2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。
二、实验原理
线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。
在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。
三、实验用品
器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。
材料：新鲜的猪肝脏。
试剂：见PAGE 64
四、实验步骤
1. 制备猪肝细胞匀浆。
实验前购买新鲜猪肝脏备用。
割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。
称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 差速离心。
先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml 肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。
3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。
4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。
5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。
5. 分离物鉴定。
①细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，加甲醇-冰醋酸液1滴固定15min，充分吹干，滴1滴姬姆萨染液染色10min。
自来水冲洗，吹干，镜检。
结果：细胞核呈紫红色，上面附着的少量胞质及浅蓝色碎片。
②线粒体：取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染色20min，覆上盖玻片，镜检。
线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
取猪肝2g
用预冷的0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤3次，
研磨成匀浆
匀浆液
多层纱布过滤，
700×g 离心10min
沉淀上清液
10000×g离心
10min 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次
每次1000×g离心15min 沉淀（线粒体）
沉淀洗涤
（细胞核及质膜碎片） 10ml 0.25M蔗糖缓冲溶液洗涤2次,
每次10000×g离心15min
镜检
沉淀
镜检
五、作业
1、根据镜检结果，绘制线粒体结构简图。
2、分离得到的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后染色，两者着色有何不同。