α-淀粉酶基因研究进展
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
遗传 Ｈ ＲＤ Ａ （ｅ ） （） ４ ８ ８ ＥＥＩ Ｓ ｉ ｇ １ ４ ７ １ Ｔ Ｂ ｊ ０ ； ｉ ｎ －４ ９ ８
ａ 淀 粉酶基 因研 究 进展 一
张 丽 娟＊
ａ淀粉酶作为一种有效的水解剂普遍 应 用于食 －
品、 酿造 、 轻纺 和造 纸等工 业中 ，是 目前生产及销 售量
Ｉ Ｋ保国 ｛
最大的酶制剂之一。用传统的诱变法筛选高产淀粉酶
菌 株以提 高淀粉酶活 性是有限 的 ，远不 能满足生 产之
需求。 如何用遗传工程的手段构建新的淀粉酶产 生
菌 ， 高淀粉酶 活性 ， 提 是迫 切需要 解决 的问题。 分子 克隆 ａ淀粉 酶基 因 ， 于提 高目的基 因的拷 一 对
贝数，进而提高淀粉酶产量，以及对于构建普遍用于 Ｂｃｌ ａｉｕ ｌ‘的分泌性载体和比较广泛分布于微生物、动 植物中的 。淀粉酶基因的进化关系都 具有 重要意 一
建了含有凝结芽抱杆菌 Ａ ｙ ｍ Ｅ基因的转导噬菌体。 从 该噬菌体中分离插入片段克隆到 ＰＲ’ Ｂ３ 上。 发 现在 ２ Ｅ ｃｌ中、 ． ｉ 不论是革兰氏阳性菌产生的信号肤， ｏ 还是革 兰氏阴性菌某些胞外酶的信号肤， 都能促使。淀粉酶 一
从 细胞 中释放。这一 特性对 于构建用于分 子克隆 的普
明，０ ９％以上的 Ａｏ 转导子是 Ａ wenku.baidu.com＋ Ｙｓｏ ｉ ｒ＋ Ｉ ｍ Ｅｏ ｎｓ ｏ ｔｈ
等ｔ３ １ 从该 ， －ｒ－ｍ Ｅ 转导噬菌 休中分 离出 ＜ ｏ Ａｏ Ａ ｙ ＂ Ｉ
Ｄ Ａ 用 ５ｕ 部分 降解 ，与 Ｂｍ Ｉ Ｎ ， ａ３ Ａ ａ Ｈ 切割 的 ｐ Ｂ １ Ｕ １Ｑ 连 接转化枯草 芽抱杆菌 。从阳性 转化子中分 离到一个 ６８６ ．ｋ 的重组质 粒 ｐ Ｕ ４ 其 中插 人 的 外 源 Ｄ Ａ 片 Ｔ Ｂ， Ｎ
通过前噬菌体转化法组建了 一个含有 Ｔｅ ｈｐｉ ｈｒ ｈ ｐｏ ｅ ｖ
Ｖ ２高温淀粉酶基因 ａｙ ＋的 ０ ０ ｍ Ｖ ２ １５转导噬菌体。
在 重组的 ０ ０－ ｍ Ｖ ＋ ，ａ ｙ 基因可以从 一 １５ａ ｙ 中 ｍ Ｖ ２ ２
个１５ｄ Ｂｍ －ｇｌ Ａ片段中回 ． 的 ａ Ｈ Ｂｌ Ｄ Ｍ Ｉ ｌ Ｎ 收到。 Ｐｒ［， ｉｒ＇ 等用 ＡＭ １经体外酶切 ｏｅ０ Ｎ ７ ８ 连接包装组
二、高温淀粉酶基因的遗传保守性
重 组 Ｄ Ａ 技术 的应用为 比较基 因之间 的进化 关 Ｎ 系提 供 了方 便。Ｒｃａ ｉ ｒ ｈ ｄ等‘， ， 用鸟 枪法 克隆 了地 衣芽 ’ 抱 杆菌 的高温淀粉 酶基 因，将 此淀 粉酶 基因与 另外 两 个 高温淀粉 酶基 因比较时发 现 ，它 们的 酶切 图谱 极为 相似 。 这 三株菌 的 。 淀粉酶 基因 在最 适温 度及对 高 一 温 的耐受性 方面是不 同 的。三株菌编 码 的酶 是有差 异 的， 但其基 因的酶 切 图谱很 相似 ，说 明编码 热稳 定 。 －
［ ］ Ｎ ｍ ｒ， ： ７． ｇｉ Ｂｏ Ｃ ｅ ８ ｏ ｕａ Ｓ １ ９ Ａ ｒ ． ｌ ｈｍ， ４（２ ． ９ ｃ ｉ． ３１）
２３－ ２３ ６７ ６８
转录下的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ带有几个核糖体结合位点， 在有效转
录酶 分子 中起重 要作用 。 从 Ｄ Ａ序列分析 中可以发 现， Ｎ 在淀粉酶 基因终 止 信 号下 游有两 个反 向重 复结 构，该 结构在转录 终止 中
受体 菌是 ｒ ＋系统。 ｅ ｃ
段为２３ｂ ．ｋ。用此ｐ Ｕ ４ Ｔ Ｂ 质粒转化 Ａ ｍ ｙ阳性感受态 细胞， 所有的卡那霉素抗性转化子均为Ａ ｙ ｍ Ｅ阳性。 由于ｐ １ Ａ分子约 ７Ｍｄ 上面带有单一酶的 １Ｄ Ｎ ８ ， 多个切点，造成回收目的基因的困难。为解决这一问
题 ，Ｓｏ ｈｊ ｉ等“ ］ ａ采用分 子量为 ２Ｍ ４ ｄ的 ０ ０ 噬菌体 ， １５
后面的第 四个 Ｔ Ａ 是 终止 密码 。 第三个 核糖 体 结 Ａ 合 位点在４ ０ ｔ ９Ｎ 附近， Ａ Ｇ为 起始密码 合成 ａ 淀粉 以 Ｔ － 酶 。因为转 译是以 Ｒ Ａ 为模板 ，所以 从 Ｄ Ａ 分子 Ｓ Ｎ
［ ］ Ｍａｉ Ｙｎ ｅ ａ． １８． ｃ ｉ Ａ ｉ ｋｔ １ ５ ｒ ａ ｇ ｌ ９３ Ｎ ｉｃ ｃ ｓ ． １ ａ ｔ ： ｕｅ ｄ ｉ，
而用Ｄ Ａ转化法得到的共转化频率为３％。由于噬 Ｎ ３ 菌体转化容易克隆到目的基因，外源基因在转化体内 不易丢失， 故很多人用此法构建基因文库， 从中分离目 的基因与载体质粒连接转化相应的受体菌。
Ｎ ｍ ｒ 〔 采用 枯草芽抱杆菌温和噬 菌体 Ｐ １ ｏ ｕａ等 ‘ ， １
义Ｅ３ ３２ １０ １
一、克隆ａ 淀粉酶基因的常用方法 －
（） ２７ ２ ９ ２ ： ３－ ４ ．
［ ］ Ｍｃ ｕｈｉ， ａ ： １８ ） Ｂｏ Ｃ ｅ ６ ｌ ｇｌ ｅ ｌ ９ １ ． ｉ． ｉ，二 ２６ ａ ｎ ｔ ． ｌ ： ５
１２ ３ １２ ． １ ８ － １ ９１
〔 ］ ｉ ｅ Ｂ ｅ ａ ：１ ０ Ｇｎ， ４一１ ． ７ Ｍｃ ｌ ． ｌ ９ ． ｅ １：１ ｈ ， ｔ ． ８ ｅ ２ ７ ５ ４
菌的。淀粉酶基因「。 一 ２ 他用内切酶 ＭｂＩ ２ Ｏ 部分降解染 色体 Ｄ Ａ 经蔗糖密度梯度离心分离， Ｎ ， 纯化２ ｋ －５ｂ片
段， 与经 Ｂ ｍ Ｉ切割 的 ｐ Ｂ １ 连接转 化感受态 枯草 ａＨ Ｕ １０ 芽 抱杆菌 Ｉ２ 对 重组 质粒 ｐ Ｔ １ 分 析表 明， 个 Ａ ８ ９ 。 Ｋ Ｈ０ 一
２４－ ２４ ３３ ３９
因的分子结构。“淀粉酶基因具有三个可能的核塘体 一 结合位点。第一个结合区域位于 ４０ ｔ ２Ｎ 附近，该区域
具 有与枯草 芽抱 杆菌 １Ｓ Ｎ 同 源顺 序 。第 二个结 ６ ｒ Ａ Ｒ 合 区域位于 ４０ ｔ附近 ，起 始密码 是 Ｔ Ｇ 而 不 是 ４Ｎ Ｔ
４（１ ３１）
Ｚ ａｇ ｊａ ｅ ａ． Ｐ ｏ ｒｓ ｏ Ｒ ｓａ ｃ ｏ ａ ｈ ｎ Ｌ ｕ ｎ ｌ ｒ ｇ ｅｓ ｅｅｒ ｈ ｔ ｉ ｉ ： ｆ ｎ － ａ ｌｓ ｍｙａｅＣｅ ｅ ｎ
．本人现在北京，中国药品生物制 品检定所工作。
本文于 １８ 年 １ ９６ １月 １ ７日收到。
斗 ，
ｐＤ ４ ｃ Ｒ位点。 Ｂ６ 的Ｅｏ Ｉ 对插人片段进行位点专一性诱
［ ］ Ｐｔ ｕ， Ｆ ｅ ａ ：１７． ｔｒ ２５ ２６ ２９ ９ ｅ ｔｚ Ｍ． ｔ ９５ Ｎａ ｅ ５ ： － ５． ｒ ． ｌ ． ｕ ， ５ （０ Ｐｅ ｅ Ｃｒｅ ｓ １８ ： Ｍｏ． 二 ｅｅ， ８－ １］ ｉ ｒ， ｎｌ ： ９２ ｒ ｏ ｉ ｌ Ｇ ．Ｇ ｎｔ １６ 。 ．
偏性分泌载休具有重要意义。
淀粉酶基因两端分别与两个衣霉素抗 性基 因连
接 。 位 于淀粉酶 基因 ５ 端上 游的 ｔ ｒ 一 ｍ Ａ具有 超过量 生产 。 淀粉 酶的 功能。ｔｒ 一 ｍ Ｂ位于基 因 ３ 端下 游， ‘ 一 对 淀粉酶 的产生 无影响。 由于衣霉素 影响细菌细 胞壁和 葡聚糖 肤的合成 ，衣霉 素伉性突变一 定会改变细 胞壁 的某 些功能。 这一现 象可以 用来解释为 什么 ａ 淀粉 － 酶基 因在 大肠杆 菌宿主 中不稳 定的 原因。经 内切 酶降
［ ］ Ｋ ｇ ｉ ， Ｍ． ａ ： １７． ｏ Ｎ ｓ Ａｏ． ． ４ ｅｇｎ Ｋ ｓ ． ． ｅ ｌ ９８ Ｐ ｃ ａ ． ｄ Ｓｉ ｔ ． ｒ ． ｔ ｃ ｃ
ＵＳ ７ ： ２－ １ ２ ． Ａ， １ ３ ４ ７ ５ ４
Ａ Ｇ Ｔ Ｇ在枯草芽抱杆菌中作为起始密码ｔ， Ｇ Ｔ ， Ｔ ｓＴ ］ Ｔ
解的Ｄ Ａ片段往往不仅含有目的基因本身， Ｎ 在其上游
和下游 带有 与其相 邻基因 的 Ｄ Ａ 片段 。如果 带有 与 Ｎ 影 响细胞壁 合成及 基因产物分 泌有关 的基因则对大 肠
淀粉酶的Ｄ Ａ区域是高度保守的。 推测酶分子的耐 Ｎ
热 性及 最适温度 的 区别 仅在于 少数几 个氨基酸 残基 的 不 同 。Ｐｒｔ ９ ｅ ｚ ’已经证 明 ，来 自两 种嗜温 芽抱 梭菌 的 ｕｔ 铁 氧还 原蛋 白基 因 ，其 中两 个碱基 对的 替换可使一 个 热不 稳定蛋 白变成 热稳定蛋 白。可 以确信 ，在 比较 了
Ｓ ｐｅＬ’ ｔ ｈｎ 等采用 ｐＵ１０ 受休）ｐＤ ４ ｅ １ ３ Ｂ １（ ／Ｂ ６ 载体系
统， 成功地 克隆 了地 衣芽抱 杆菌高温 ａ 淀粉 酶基因 。 － 他用 Ｅｏ 降解 Ｆ ０ 染 色体 Ｄ Ａ 与经 Ｅｏ 切 割 ｃ Ｒ Ｉ Ｄ２ Ｎ ， ｃＲ Ｉ
的ｐＤ ４ Ｂ ６ 连接转化含有 ｐ Ｂ１ 的受体菌枯草芽抱杆 Ｕ １０ 菌５ １３ 筛选出不含 ｐＢ １ 的转化子。 ０ ０， Ｕ １０ 该方法可以 提高转化频率１０ ０。 ０－１０ 倍。外源基因在受体菌中可 以稳定地维持并表达。 一长度为３５ｋ 的片段插入到 ．５ｂ
１鸟枪法克隆 。淀粉酶基因 ． 一 自从 Ｋ ｇｉ ｅｇ ｓ ｎ 等Ｌ 首次以ｐ Ｂ１ 为载体鸟枪法克隆枯草芽抱杆菌 ４ ３ Ｕ １０ ｔＣ ｒ Ｐ２片段后，又陆续有人使用此法克隆了其它几 个
基 因「” ａ ａ ， 。Ｐｌ 用该方法成 功地 克隆了解 淀粉芽抱 杆 ， ｖ
构建了含有 Ａｏ Ａ ｙ 的专一性转导噬菌体。并发 ｒ－ｍ Ｅ Ｉ 现， Ｅｏ 用 ｃＲ Ｉ降解染色体Ｄ Ａ Ａｏ与 Ａ ｙ Ｎ ， Ｉ ｍ Ｅ之间 ｒ 的连锁关系完全丧失，用 Ｂｍ 降解时则保留３ ａ Ｈ Ｉ － ５ 的共转化频率。对转导噬菌体淀粉酶活性测定表 ％
列以后 ， ’ 可找 出由于个别 氨基 酸残基 的不 同导致 “了 即 二者在 特性上 的不一 致。
相同的。同时也暗示不同的枯草杆菌在淀粉酶分泌过
程中 具有一相 同的调节机 制。
三、ａ 淀粉酶基因的分子结构 －
Ｍ ｒｔ 成功地克隆了枯草芽抱杆菌淀粉酶基因， ａｉ＇ ａ’
并对编 码区进 行了序 列分析 ， 首次 揭示了 。 淀粉 酶基 一
杆菌的生长有不良影响， 造成克隆基因的不稳定性。
枯 草芽 抱杆 菌和解淀 粉芽抱杆 菌的 。 淀粉 酶 在 一 酶学特 性及免 座学特性 上完全不 同 ，其氨 基末端 的氨 基酸 序列没有 同源性 ，但 两基 因的信号肤 序列是一致 的。这一 现象说 明信号肤 在蛋 白质 运输中起 的作用是
ｐＰ 和 ｐ ３ 二者的淀粉酶基因编码区的核营酸序 ＲＩ Ｓ ３ Ａ
变 ，一 粉 基因 ． ｂ 证明 ａ淀 酶 约１ ｋ ８ｏ
３前噬菌体转化法克隆 ａ淀粉酶基 因 ． － 在枯 草杆菌染色体中，－ ａ淀粉酶基因与Ａｏ ｒＩ 基因连锁， 用
噬 菌体 Ｐ Ｓ得 到的 Ａｏ Ａ ｙ 共转导 频率 为 ８％ ， ＢＩ ｒ－ ｍ Ｅ ｌ ５
（ 黑龙江省应 用微生物研 究所 ， 哈尔 滨）
３７ ３９ ０－ ２．
参
考
文
献
［ ］ Ｇｙ ａ， Ｊ ｅａ： ２ Ｉ： ｅ ；ｎ ｒ － １ ｒ ｚ Ｔ ． ｌ １８． Ｔ Ｍ ｅ ！ Ｂ ｃ ｎ ． ｔ ９ ｎ ｈ ｏｃ ａ ｉ ． ｏ
ｌ ｙ ｔ Ｂｃ ｌ Ｖ ｌ １ Ｂｃｌｓ ｂｉｓ ｐ． ｏ ｏ ｈ ａｉｉ ｏ ， ａｉｕ ｓ ｒ ｉ ｇ ｆ ｅ ｌ， ． ｌ ｕ ｌ， ｐ ［ ］ ｉｋ Ｐｉ ： ８． ｎ， ： － ８． ２ ｌ ａ ｖ １ ２ Ｇ ｅ １ ８ ｋ ａａ ９ ｃ ９ １ ７ ［ ］ Ｋ ｚｍ ｓ Ｈ ： ７． ｇｉ Ｂｏ Ｃ 。 ３ ａｕ ａａ ． １ ９ Ａ ｒ ． ｌ ｈ二 ， ９ ｃ ｉ ．
２３６ ．ｋ片段插人到 ｐ Ｂ１ Ｕ １０的Ｂｍ 位点。该菌株产 ａ Ｈ Ｉ 生的ａ淀粉酶是供体菌的 ５ 是野生型的２０ 倍。 － 倍， ５０ ２重组获救法克隆ａ淀粉酶基因 ． 一 Ｃｎ ｎ ｏｔ ｔ ｅ ｅ等 发展的质粒重组获救系统是枯草芽抱杆菌分子克隆获 得高转化频率的重要手段。载体Ｄ Ａ进入细胞后， Ｎ 可 通过与受体细胞中预存的与载体 Ｄ Ａ同源部分发生 Ｎ 重组，产生有活性的质粒分子。该方法在分子克隆中 特别是克隆异源 Ｄ Ａ时是十分有效的。该系统要求 Ｎ
ａ 淀 粉酶基 因研 究 进展 一
张 丽 娟＊
ａ淀粉酶作为一种有效的水解剂普遍 应 用于食 －
品、 酿造 、 轻纺 和造 纸等工 业中 ，是 目前生产及销 售量
Ｉ Ｋ保国 ｛
最大的酶制剂之一。用传统的诱变法筛选高产淀粉酶
菌 株以提 高淀粉酶活 性是有限 的 ，远不 能满足生 产之
需求。 如何用遗传工程的手段构建新的淀粉酶产 生
菌 ， 高淀粉酶 活性 ， 提 是迫 切需要 解决 的问题。 分子 克隆 ａ淀粉 酶基 因 ， 于提 高目的基 因的拷 一 对
贝数，进而提高淀粉酶产量，以及对于构建普遍用于 Ｂｃｌ ａｉｕ ｌ‘的分泌性载体和比较广泛分布于微生物、动 植物中的 。淀粉酶基因的进化关系都 具有 重要意 一
建了含有凝结芽抱杆菌 Ａ ｙ ｍ Ｅ基因的转导噬菌体。 从 该噬菌体中分离插入片段克隆到 ＰＲ’ Ｂ３ 上。 发 现在 ２ Ｅ ｃｌ中、 ． ｉ 不论是革兰氏阳性菌产生的信号肤， ｏ 还是革 兰氏阴性菌某些胞外酶的信号肤， 都能促使。淀粉酶 一
从 细胞 中释放。这一 特性对 于构建用于分 子克隆 的普
明，０ ９％以上的 Ａｏ 转导子是 Ａ wenku.baidu.com＋ Ｙｓｏ ｉ ｒ＋ Ｉ ｍ Ｅｏ ｎｓ ｏ ｔｈ
等ｔ３ １ 从该 ， －ｒ－ｍ Ｅ 转导噬菌 休中分 离出 ＜ ｏ Ａｏ Ａ ｙ ＂ Ｉ
Ｄ Ａ 用 ５ｕ 部分 降解 ，与 Ｂｍ Ｉ Ｎ ， ａ３ Ａ ａ Ｈ 切割 的 ｐ Ｂ １ Ｕ １Ｑ 连 接转化枯草 芽抱杆菌 。从阳性 转化子中分 离到一个 ６８６ ．ｋ 的重组质 粒 ｐ Ｕ ４ 其 中插 人 的 外 源 Ｄ Ａ 片 Ｔ Ｂ， Ｎ
通过前噬菌体转化法组建了 一个含有 Ｔｅ ｈｐｉ ｈｒ ｈ ｐｏ ｅ ｖ
Ｖ ２高温淀粉酶基因 ａｙ ＋的 ０ ０ ｍ Ｖ ２ １５转导噬菌体。
在 重组的 ０ ０－ ｍ Ｖ ＋ ，ａ ｙ 基因可以从 一 １５ａ ｙ 中 ｍ Ｖ ２ ２
个１５ｄ Ｂｍ －ｇｌ Ａ片段中回 ． 的 ａ Ｈ Ｂｌ Ｄ Ｍ Ｉ ｌ Ｎ 收到。 Ｐｒ［， ｉｒ＇ 等用 ＡＭ １经体外酶切 ｏｅ０ Ｎ ７ ８ 连接包装组
二、高温淀粉酶基因的遗传保守性
重 组 Ｄ Ａ 技术 的应用为 比较基 因之间 的进化 关 Ｎ 系提 供 了方 便。Ｒｃａ ｉ ｒ ｈ ｄ等‘， ， 用鸟 枪法 克隆 了地 衣芽 ’ 抱 杆菌 的高温淀粉 酶基 因，将 此淀 粉酶 基因与 另外 两 个 高温淀粉 酶基 因比较时发 现 ，它 们的 酶切 图谱 极为 相似 。 这 三株菌 的 。 淀粉酶 基因 在最 适温 度及对 高 一 温 的耐受性 方面是不 同 的。三株菌编 码 的酶 是有差 异 的， 但其基 因的酶 切 图谱很 相似 ，说 明编码 热稳 定 。 －
［ ］ Ｎ ｍ ｒ， ： ７． ｇｉ Ｂｏ Ｃ ｅ ８ ｏ ｕａ Ｓ １ ９ Ａ ｒ ． ｌ ｈｍ， ４（２ ． ９ ｃ ｉ． ３１）
２３－ ２３ ６７ ６８
转录下的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ带有几个核糖体结合位点， 在有效转
录酶 分子 中起重 要作用 。 从 Ｄ Ａ序列分析 中可以发 现， Ｎ 在淀粉酶 基因终 止 信 号下 游有两 个反 向重 复结 构，该 结构在转录 终止 中
受体 菌是 ｒ ＋系统。 ｅ ｃ
段为２３ｂ ．ｋ。用此ｐ Ｕ ４ Ｔ Ｂ 质粒转化 Ａ ｍ ｙ阳性感受态 细胞， 所有的卡那霉素抗性转化子均为Ａ ｙ ｍ Ｅ阳性。 由于ｐ １ Ａ分子约 ７Ｍｄ 上面带有单一酶的 １Ｄ Ｎ ８ ， 多个切点，造成回收目的基因的困难。为解决这一问
题 ，Ｓｏ ｈｊ ｉ等“ ］ ａ采用分 子量为 ２Ｍ ４ ｄ的 ０ ０ 噬菌体 ， １５
后面的第 四个 Ｔ Ａ 是 终止 密码 。 第三个 核糖 体 结 Ａ 合 位点在４ ０ ｔ ９Ｎ 附近， Ａ Ｇ为 起始密码 合成 ａ 淀粉 以 Ｔ － 酶 。因为转 译是以 Ｒ Ａ 为模板 ，所以 从 Ｄ Ａ 分子 Ｓ Ｎ
［ ］ Ｍａｉ Ｙｎ ｅ ａ． １８． ｃ ｉ Ａ ｉ ｋｔ １ ５ ｒ ａ ｇ ｌ ９３ Ｎ ｉｃ ｃ ｓ ． １ ａ ｔ ： ｕｅ ｄ ｉ，
而用Ｄ Ａ转化法得到的共转化频率为３％。由于噬 Ｎ ３ 菌体转化容易克隆到目的基因，外源基因在转化体内 不易丢失， 故很多人用此法构建基因文库， 从中分离目 的基因与载体质粒连接转化相应的受体菌。
Ｎ ｍ ｒ 〔 采用 枯草芽抱杆菌温和噬 菌体 Ｐ １ ｏ ｕａ等 ‘ ， １
义Ｅ３ ３２ １０ １
一、克隆ａ 淀粉酶基因的常用方法 －
（） ２７ ２ ９ ２ ： ３－ ４ ．
［ ］ Ｍｃ ｕｈｉ， ａ ： １８ ） Ｂｏ Ｃ ｅ ６ ｌ ｇｌ ｅ ｌ ９ １ ． ｉ． ｉ，二 ２６ ａ ｎ ｔ ． ｌ ： ５
１２ ３ １２ ． １ ８ － １ ９１
〔 ］ ｉ ｅ Ｂ ｅ ａ ：１ ０ Ｇｎ， ４一１ ． ７ Ｍｃ ｌ ． ｌ ９ ． ｅ １：１ ｈ ， ｔ ． ８ ｅ ２ ７ ５ ４
菌的。淀粉酶基因「。 一 ２ 他用内切酶 ＭｂＩ ２ Ｏ 部分降解染 色体 Ｄ Ａ 经蔗糖密度梯度离心分离， Ｎ ， 纯化２ ｋ －５ｂ片
段， 与经 Ｂ ｍ Ｉ切割 的 ｐ Ｂ １ 连接转 化感受态 枯草 ａＨ Ｕ １０ 芽 抱杆菌 Ｉ２ 对 重组 质粒 ｐ Ｔ １ 分 析表 明， 个 Ａ ８ ９ 。 Ｋ Ｈ０ 一
２４－ ２４ ３３ ３９
因的分子结构。“淀粉酶基因具有三个可能的核塘体 一 结合位点。第一个结合区域位于 ４０ ｔ ２Ｎ 附近，该区域
具 有与枯草 芽抱 杆菌 １Ｓ Ｎ 同 源顺 序 。第 二个结 ６ ｒ Ａ Ｒ 合 区域位于 ４０ ｔ附近 ，起 始密码 是 Ｔ Ｇ 而 不 是 ４Ｎ Ｔ
４（１ ３１）
Ｚ ａｇ ｊａ ｅ ａ． Ｐ ｏ ｒｓ ｏ Ｒ ｓａ ｃ ｏ ａ ｈ ｎ Ｌ ｕ ｎ ｌ ｒ ｇ ｅｓ ｅｅｒ ｈ ｔ ｉ ｉ ： ｆ ｎ － ａ ｌｓ ｍｙａｅＣｅ ｅ ｎ
．本人现在北京，中国药品生物制 品检定所工作。
本文于 １８ 年 １ ９６ １月 １ ７日收到。
斗 ，
ｐＤ ４ ｃ Ｒ位点。 Ｂ６ 的Ｅｏ Ｉ 对插人片段进行位点专一性诱
［ ］ Ｐｔ ｕ， Ｆ ｅ ａ ：１７． ｔｒ ２５ ２６ ２９ ９ ｅ ｔｚ Ｍ． ｔ ９５ Ｎａ ｅ ５ ： － ５． ｒ ． ｌ ． ｕ ， ５ （０ Ｐｅ ｅ Ｃｒｅ ｓ １８ ： Ｍｏ． 二 ｅｅ， ８－ １］ ｉ ｒ， ｎｌ ： ９２ ｒ ｏ ｉ ｌ Ｇ ．Ｇ ｎｔ １６ 。 ．
偏性分泌载休具有重要意义。
淀粉酶基因两端分别与两个衣霉素抗 性基 因连
接 。 位 于淀粉酶 基因 ５ 端上 游的 ｔ ｒ 一 ｍ Ａ具有 超过量 生产 。 淀粉 酶的 功能。ｔｒ 一 ｍ Ｂ位于基 因 ３ 端下 游， ‘ 一 对 淀粉酶 的产生 无影响。 由于衣霉素 影响细菌细 胞壁和 葡聚糖 肤的合成 ，衣霉 素伉性突变一 定会改变细 胞壁 的某 些功能。 这一现 象可以 用来解释为 什么 ａ 淀粉 － 酶基 因在 大肠杆 菌宿主 中不稳 定的 原因。经 内切 酶降
［ ］ Ｋ ｇ ｉ ， Ｍ． ａ ： １７． ｏ Ｎ ｓ Ａｏ． ． ４ ｅｇｎ Ｋ ｓ ． ． ｅ ｌ ９８ Ｐ ｃ ａ ． ｄ Ｓｉ ｔ ． ｒ ． ｔ ｃ ｃ
ＵＳ ７ ： ２－ １ ２ ． Ａ， １ ３ ４ ７ ５ ４
Ａ Ｇ Ｔ Ｇ在枯草芽抱杆菌中作为起始密码ｔ， Ｇ Ｔ ， Ｔ ｓＴ ］ Ｔ
解的Ｄ Ａ片段往往不仅含有目的基因本身， Ｎ 在其上游
和下游 带有 与其相 邻基因 的 Ｄ Ａ 片段 。如果 带有 与 Ｎ 影 响细胞壁 合成及 基因产物分 泌有关 的基因则对大 肠
淀粉酶的Ｄ Ａ区域是高度保守的。 推测酶分子的耐 Ｎ
热 性及 最适温度 的 区别 仅在于 少数几 个氨基酸 残基 的 不 同 。Ｐｒｔ ９ ｅ ｚ ’已经证 明 ，来 自两 种嗜温 芽抱 梭菌 的 ｕｔ 铁 氧还 原蛋 白基 因 ，其 中两 个碱基 对的 替换可使一 个 热不 稳定蛋 白变成 热稳定蛋 白。可 以确信 ，在 比较 了
Ｓ ｐｅＬ’ ｔ ｈｎ 等采用 ｐＵ１０ 受休）ｐＤ ４ ｅ １ ３ Ｂ １（ ／Ｂ ６ 载体系
统， 成功地 克隆 了地 衣芽抱 杆菌高温 ａ 淀粉 酶基因 。 － 他用 Ｅｏ 降解 Ｆ ０ 染 色体 Ｄ Ａ 与经 Ｅｏ 切 割 ｃ Ｒ Ｉ Ｄ２ Ｎ ， ｃＲ Ｉ
的ｐＤ ４ Ｂ ６ 连接转化含有 ｐ Ｂ１ 的受体菌枯草芽抱杆 Ｕ １０ 菌５ １３ 筛选出不含 ｐＢ １ 的转化子。 ０ ０， Ｕ １０ 该方法可以 提高转化频率１０ ０。 ０－１０ 倍。外源基因在受体菌中可 以稳定地维持并表达。 一长度为３５ｋ 的片段插入到 ．５ｂ
１鸟枪法克隆 。淀粉酶基因 ． 一 自从 Ｋ ｇｉ ｅｇ ｓ ｎ 等Ｌ 首次以ｐ Ｂ１ 为载体鸟枪法克隆枯草芽抱杆菌 ４ ３ Ｕ １０ ｔＣ ｒ Ｐ２片段后，又陆续有人使用此法克隆了其它几 个
基 因「” ａ ａ ， 。Ｐｌ 用该方法成 功地 克隆了解 淀粉芽抱 杆 ， ｖ
构建了含有 Ａｏ Ａ ｙ 的专一性转导噬菌体。并发 ｒ－ｍ Ｅ Ｉ 现， Ｅｏ 用 ｃＲ Ｉ降解染色体Ｄ Ａ Ａｏ与 Ａ ｙ Ｎ ， Ｉ ｍ Ｅ之间 ｒ 的连锁关系完全丧失，用 Ｂｍ 降解时则保留３ ａ Ｈ Ｉ － ５ 的共转化频率。对转导噬菌体淀粉酶活性测定表 ％
列以后 ， ’ 可找 出由于个别 氨基 酸残基 的不 同导致 “了 即 二者在 特性上 的不一 致。
相同的。同时也暗示不同的枯草杆菌在淀粉酶分泌过
程中 具有一相 同的调节机 制。
三、ａ 淀粉酶基因的分子结构 －
Ｍ ｒｔ 成功地克隆了枯草芽抱杆菌淀粉酶基因， ａｉ＇ ａ’
并对编 码区进 行了序 列分析 ， 首次 揭示了 。 淀粉 酶基 一
杆菌的生长有不良影响， 造成克隆基因的不稳定性。
枯 草芽 抱杆 菌和解淀 粉芽抱杆 菌的 。 淀粉 酶 在 一 酶学特 性及免 座学特性 上完全不 同 ，其氨 基末端 的氨 基酸 序列没有 同源性 ，但 两基 因的信号肤 序列是一致 的。这一 现象说 明信号肤 在蛋 白质 运输中起 的作用是
ｐＰ 和 ｐ ３ 二者的淀粉酶基因编码区的核营酸序 ＲＩ Ｓ ３ Ａ
变 ，一 粉 基因 ． ｂ 证明 ａ淀 酶 约１ ｋ ８ｏ
３前噬菌体转化法克隆 ａ淀粉酶基 因 ． － 在枯 草杆菌染色体中，－ ａ淀粉酶基因与Ａｏ ｒＩ 基因连锁， 用
噬 菌体 Ｐ Ｓ得 到的 Ａｏ Ａ ｙ 共转导 频率 为 ８％ ， ＢＩ ｒ－ ｍ Ｅ ｌ ５
（ 黑龙江省应 用微生物研 究所 ， 哈尔 滨）
３７ ３９ ０－ ２．
参
考
文
献
［ ］ Ｇｙ ａ， Ｊ ｅａ： ２ Ｉ： ｅ ；ｎ ｒ － １ ｒ ｚ Ｔ ． ｌ １８． Ｔ Ｍ ｅ ！ Ｂ ｃ ｎ ． ｔ ９ ｎ ｈ ｏｃ ａ ｉ ． ｏ
ｌ ｙ ｔ Ｂｃ ｌ Ｖ ｌ １ Ｂｃｌｓ ｂｉｓ ｐ． ｏ ｏ ｈ ａｉｉ ｏ ， ａｉｕ ｓ ｒ ｉ ｇ ｆ ｅ ｌ， ． ｌ ｕ ｌ， ｐ ［ ］ ｉｋ Ｐｉ ： ８． ｎ， ： － ８． ２ ｌ ａ ｖ １ ２ Ｇ ｅ １ ８ ｋ ａａ ９ ｃ ９ １ ７ ［ ］ Ｋ ｚｍ ｓ Ｈ ： ７． ｇｉ Ｂｏ Ｃ 。 ３ ａｕ ａａ ． １ ９ Ａ ｒ ． ｌ ｈ二 ， ９ ｃ ｉ ．
２３６ ．ｋ片段插人到 ｐ Ｂ１ Ｕ １０的Ｂｍ 位点。该菌株产 ａ Ｈ Ｉ 生的ａ淀粉酶是供体菌的 ５ 是野生型的２０ 倍。 － 倍， ５０ ２重组获救法克隆ａ淀粉酶基因 ． 一 Ｃｎ ｎ ｏｔ ｔ ｅ ｅ等 发展的质粒重组获救系统是枯草芽抱杆菌分子克隆获 得高转化频率的重要手段。载体Ｄ Ａ进入细胞后， Ｎ 可 通过与受体细胞中预存的与载体 Ｄ Ａ同源部分发生 Ｎ 重组，产生有活性的质粒分子。该方法在分子克隆中 特别是克隆异源 Ｄ Ａ时是十分有效的。该系统要求 Ｎ