淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌(amp+)中的表达

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达

一、相关背景

淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。

淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类:第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。

除此之外，不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性α-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中，常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上，β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。

二、目前研究情况

1 .国内外研究机构

由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，国内外很多课题组对它进行了研究。国内主要研究α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件；α-淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；淀粉酶的变性机理以及环境对α-淀粉酶的影响；淀粉酶的固定化和动力性质；对多种α-淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。

国外有代表性的研究单位有：加拿大的University of British Columbia，他们对人胰腺的α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦α-淀粉酶结构域与结合位点；美国的Westenr Regional Research Center主要研究大麦

的α-淀粉酶与抗菌素的作用以及大麦一淀粉酶的活性位点。

2.国内外α-淀粉酶研究方向

第一利用传统育种技术对生产菌进行改良；第二对不同来源的α-淀粉酶的基因进行克隆．表达及酶学性质研究；第三α-淀粉酶结构与功能关系的研究。

三、实验研究的目标

构建出α-淀粉酶基因，并使其在大肠杆菌（amp+）中进行表达。希望可以通过实验对α-淀粉酶基因的一些功能进行研究。

四、简略研究步骤

DNA提取——>（电泳鉴定）——> PCR扩增（引物设计）——>（电泳鉴定）——>电泳——>目标带回收——>（电泳鉴定）——>连接载体（质粒）——>转化大肠杆菌——>菌体PCR检测

五、相关实验详细介绍

Ⅰ DNA提取

Ⅱ SDS法提取DNA

（一）试剂及器材：

1．母液：

（1）1M Tris-HCl：称Tris-Base 12.1g，双蒸水溶解，定容至100ml，用浓HCl调pH8.0(pH8.0)。

（2）0.25M EDTA：称Na2EDTA〃2H2O9.3g，双蒸水溶解，定容至100ml，用NaOH调pH8.0（pH8.0）。

（3）2M NaCl：称NaCl 11.6g，双蒸水溶解，定容至100ml。2．SDS bulfer：

取母液中1M Tris-HCl 10ml，0.25M EDTA 20ml，2M NaCl 25ml，定容至100ml，加SDS2g混合。

3．5M醋酸钾：称醋酸钾49g，双蒸水溶解，定容至100ml，乙酸调pH4.8。

4．TE：(10m M Tris-HCl，0.1m MEDTA)1M Tris-HCl 1ml，40μlEDTA 99ml双蒸水。

5．3M 醋酸钠（pH5.2）：称醋酸钠3H2O 40.8g双蒸水溶解定容，固体NaOH调pH至5.2。

6．Tris-饱和酚。

7．其它：离心机、研钵，7ml离心管，1.5ml离心管，大小枪头，异丙醇，75%乙醇等。

（二）步骤：

1．取湿菌体约400mg（5ml发醇液），8000rpm，离心5min，弃上清

将湿菌体放入研钵中，加液N2(-180℃) 约20ml研磨3~5次，2管1.5ml离心管取粉末约0.5ml，各加700μl预热的SDSbuffer，65℃保温1h，7000rpm 离心6min取上清。

2．加上清2/3体积（约500μl）的5M KAC溶液，4℃，放臵30min，12000rpm，离心10min，取上清

3．加入等体积的异丙醇，-20℃，2小时以上，或过夜，4℃，8000rpm，离心5min，收集DNA沉淀，75%乙醇洗涤2次，离心管口向下晾干，50μl双蒸水（即ddH2O）溶解。

4．Tris-饱和酚，抽提3次。

5．加1/10体积的3M NaAc (pH5.2) ,4℃，放臵10min，10000rpm，离心10min，取上清。

6．2倍酒精沉淀。

7．75%酒精洗2次，凉干，50μl双蒸水溶解。

一般情况下，做前3步即可。

2电泳

（一）试剂及器材：

1．50×TAE Buffer pH8.5 1L(2M Tris-醋酸，100m MEDTA)

称Tris-Base 242g，Na2 EDTA〃2H2O 37.2g加800ml双蒸水，充分混匀搅拌，加57.1ml醋酸，加双蒸水定容到1L，室温保存。

2．1×TAE（取20ml 50×TAE+双蒸水定容至1L）

3．电泳仪、大小枪头、离心管，溴化乙淀，mark（d2000）等。（二）步骤：

1．取20ml（1×TAE）液体，称0.20g琼脂糖，混合，加热溶化，，倒入插有梳子的电泳槽中，冷却、凝固，

2．取出梳子，向槽中倒入TAE溶液至淹没胶块，样品5μl与1μl溴汾兰在塑料皮上混匀后点样入胶孔内（注意不能有泡），加盖，通电，电压100V，电流45mA，40min后，关闭电源。

3．打开盖子，倒去TAE，取出胶块，在EB中染色5min，后用蒸馏水漂洗干净，紫外分析仪中（260nm），观察电泳条带。

3 PCR扩增

（一）试剂及器材：

DNA提取物，Taq酶，Buffer，双蒸无菌水（灭菌过滤），PCR仪，电泳仪，离心机等。

（二）步骤：

1．PCR扩增，先设定程序，94℃，3min。（94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min）×30。72℃，5min。及94℃，5min。（93℃，50s；46℃，