免疫组化常见问题的处理
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组织化学技术标准化及常见问题的处理
１１ 染 色前 的处理 ．
正确 的取 材 、 脱水 、 浸蜡 十 分 重
１ ２ １ 内源性 过氧 化 物 酶 的灭 活 如 果 采用 过 氧化 ． ． 物酶 检测 系统 ， 则必 须 对 内源 性 过 氧化 物 酶 进行 封 闭
要， 组织 材料处 理是 获得 良好结果 的前 提 ， 须保证 要 必 检测 的细胞 或 组 织 取 材 新 鲜 、 固定 及 时 ， 态 保 存 良 形
免疫 组织化 学 技术 标 准化及 常见 问题 的处理
黄世琪 宋 芳 郝 奋 韩 秀雁
（ 包头 医学院组 织学与胚胎 学教研 室， 内蒙古 包头 ０ ４ ６ ） １０ ０
随着单克 隆抗 体技 术 的 迅速 发 展 ， 疫组 织 化 学 免 染色 已成为广 泛应用 的实 验手段 ， 尽管 其理 论很简单 ， 但在实 际操作 中还存 在 着许 多有 待 商讨 的 问题 ， 多 诸
选 择酶消 化 法 。加 热 抗 原 修 复 法是 １９ ９ １年 Ｓ ｉ ｈ 等 报 道 的 ， 理后使 免疫组 化染 色 的敏 感度 大大提高 ， 处 其 机 制还不 十分清楚 ， 推测 可 能是 加 热 打开 了组织 抗 原
因福尔马林 固定 引起 的抗原 决定簇 的交联 。常用 的加
为保证实 验 的顺 利进 行 ， 般需 采 用 黏 附剂 对 已清 洗 一 的载玻 片进行 处理 ， 常用 的 有 Ａ Ｅ 、ｏｙ—Ｌ—Ｌｓ 、 Ｐ Ｓ Ｐｌ ｙｉ ｎ Ｈ ｓ ｇｉ 。 。切 片 的厚 度应在 ４～ ｍ， 厚 的切片 ｉｏｒ 等 ｔ ｐＭ ５ 过 不仅 容易脱 片 ， 还影 响免 疫反 应 和观察 效 果 。高 温烤
［ ］ 葛友华 ， ３ 袁健． 课堂教学手段合理运用 的探索 ［ ］黑龙江 Ｊ． 教育（ 高教研究 与评估 ） ２０ ，７—８ ：３ ，０７ （ ） １６—１７ ３．
免疫组化技术常见问题及处理方法共62页
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
免疫组化技术常见问题及处理方法
11、用道德的示范来造就一个人，显然比用法律来约束他更有价值。—— 希腊
12、法律是无私的，对谁都一视同仁。在每件事上，她都不徇私情。—— 托马斯
13、公正的法律限制不了好的自由，因为好人不会去做法律不允许的事 情。——弗劳德
14、法律是为了保护无辜而制定的。——爱略特 15、像房子一样，法律和法律都是相互依存的。———周 恩来
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
免疫组化技术常见问题及处理方法
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
免疫组化技术常见问题及处理方法
SP法
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
免疫组化技术常见问题及处理方法
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
免疫组化病理技术质量控制问题及对策分析
免疫组化病理技术质量控制问题及对策分析摘要：目的：研究免疫组化病理技术质量控制问题及对策。
方法：选择2020年01月－2021年12月到本院接受免疫病理诊断的患者50例，对全部患者实施常规病理免疫组化制片、免疫组化病理技术质控管理后制片。
结果：实验组总有效制片率49（98.00%）高于对照组37（74.00%），P＜0.05。
结论：运用免疫组化病理技术对疾病诊断价值较高，更需探析质量控制存在的问题，分析相关对策。
关键词：免疫组化病理技术；质量控制；问题；对策免疫组化病理技术是目前临床比较普遍运用的一种病理检测技术，此技术的运用可提高病理诊断准确度。
但需意识到，此种技术的运用对技术和操作技能要求高。
若是检测中任意一环发生问题，都会严重地影响到制片的效果。
为了保障免疫组化病理诊断的准确度，操作流程要按照病理流程开展，使得免疫组化流程更为科学。
这就需重点对技术质量控制，探析质控存在的问题，依照问题分析解决对策，旨在提升制片质量和有效概率[1]。
基于此，本文将分析免疫组化病理技术质量控制问题及对策，报道如下：1.一般资料与方法1.1一般资料选择2020年01月－2021年12月到本院接受免疫病理诊断的患者50例，对全部患者实施常规病理免疫组化制片、免疫组化病理技术质控管理后制片，患者平均年龄（46.14±2.31）岁，一般资料（P＞0.05），探析质控问题和解决对策，评估诊断价值。
1.2方法两组内患者均选取相同的实验试剂，其中包含：甲醛、无水乙醇、二甲苯、伊红染液、苏木素染液、DAB液等。
运用莱卡RM2235组织切片设备、樱花Tissue_TekVIP5Jr智能环保生物组织脱水设备、恒温干燥箱设备以及生物组织摊烤片机设备。
全部标本都接受常规的脱水处理、浸蜡处理以及包埋后切片处理等等，标本面积需控在1.5×2cm，切片厚度4—6um。
对照组操作是传统的切片操作，而实验组操作是质量控制之后的切片操作。
免疫组织化学常见问题和解决方法
巨噬细胞吞噬各种抗原物质或 Fc 片断而出现胞浆着色 内源性生物素的着色
组织在缓冲液（如二甲苯）中 浸泡时间太长 组织变干 不适当的修复方式
较多的切片 如果制片过程中，因丙酮逐渐 挥发而胶变浓时可适当加入一 些丙酮。 加一抗前的血清封闭避免非特 异型的结合
将抗体分装在小管中，冻存于 -20 度，每次使用取一管，避 免抗体反复冻融及交叉污染。 可用过氧化氢封闭去除内源酶 导致的非特异性着色 通过形态学辨认出巨噬细胞
余的缓冲液（但防止切片干燥）
孵育时切片未放平，导致抗体 孵育时，注意切片应水平放置
流失
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过 10 分钟
不适当的标本固定方式
选择合适的固定方法
不适当的抗原修复方式
延长抗原修复时间，或者调整
抗原修复体系，建议参照生产
厂家的说明，同时结合标本的
具体情况来确定
抗体浓度过高
降低抗体滴度（一般只浓缩性
3. 非 特异 性背 景染 色
全片着色
切片边缘着色
“阴阳脸”着色 灶片状着色
少于 60 分钟
抗体孵育时间过短
抗体孵育时间不能少于 60 分
钟
标本中目的蛋白表达量低
查阅文献或数据库，确定组织
中确有目的蛋白强表达。设立
阳性对照片，以验证实验结果
操作中，切片遗留太多冲洗液， 每步滴加试剂前沥干切片中多
导致试剂稀释
免疫组织化学常见问题和解决方法
免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组 织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。它把免疫反应的特异性、组织化学的可 见性和分子生物技术的敏感性等巧妙结合，借助显微镜的显像和放大作用，在 细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以 及受体等），是单一的静止的形态学描述，上升到结构、功能和代谢为一体的动 态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发病机制的研究提供了强有力的手段。
免疫组化经验总结第一部分步骤及常见问题
免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。
肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。
2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。
⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。
切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。
（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。
如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。
再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。
但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。
第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。
6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。
滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。
免疫组织化学染色过程中出现问题及对策
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
免疫组化常见问题
免疫组化常见问题免疫组化常见问题与回答集锦一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC 的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4 μm 左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
2.应用范围的选择。
有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
3.种属反应性的选择。
这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
免疫组化技术常见问题及处理方法
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
04
仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
THANK YOU
感谢聆听
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结１、方法操作不难,最大得难处就是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样您才敢大胆地改革先前得不对得方法步骤。
如抗体孵育条件主要就是抗体浓度、温度、时间,这三者一般就是相互成反比得(相对),其中浓度就是最重要得先决条件,温度决定反应得速度、时间决定反应得量。
就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温与,背景较浅;而３７度反应速度较快,时间较短;室温我不太提倡,除非您每次都把环境温度控制在一定得范围,否则,尽量选择前两者。
２、免疫组化最大得优势就是定位与定性。
相比于其她蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确,就是定位检测分析首选方法、尤其对于有些因子得转位研究十分有用。
３、免疫组化结果定量分析得前提就是高质量得染色切片。
免疫组化结果也能定量分析,但必须就是背景染色浅而特异性染色较深得情况下,分析最为准确,这种原则可能也4、免疫组化实验一定要设置阳就是我们日常审稿时判定研究结果得必备条件。
ﻫ性对照与阴性对照。
阳性对照一般就是用肯定表达这种抗原得切片来做;阴性对照一般就是用ＰＢS或非一抗替代一抗来进行反应,其余步骤均一致。
前者就是排除方法与实验系统有无问题;后者就是排除有无一抗外得非特异性染色、5、免疫组化得应用广泛,就是当前实验研究得最重要方法之一、如今发SCI论文时,明显感觉仅靠量化得数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎,可能就是怕您学术造假吧、当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否得鉴定标准就是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良得染色切片、我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟得反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质得切片与同一种抗体,做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗得种属来源都拿错了。
免疫组化常见问题及解决办法
组化常见问题及解决办法当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
②切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
非特异性染色① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
②一抗的使用浓度是否过高。
③清洗是否充分。
应严格操作规程。
免疫组化问题及解决办法
1、染色过强
原因
解决办法
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长
降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高，孵育温度超过37℃
一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓ห้องสมุดไป่ตู้过高
显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染色
原因
解决办法
操作过程中冲洗不充分
每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断
可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长
组织中含内源性生物素
正常非免疫动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分
延长血清蛋白封闭时间
3、染色弱
原因
解决办法
抗体浓度过低，孵育时间过短
提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期
及时更换试剂
一抗与二抗种属连接错误
仔细确定一抗与二抗种属无误
操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释
每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
室温太低，低于15℃
若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
蛋白封闭过度
封闭时间不要超过10分钟
4、染色阴性
原因
解决办法
操作步骤错误
重新试验，设立阳性对照
组织中无抗原
设立阳性对照片，以验证实验结果
5.免疫组化染色中常见问题及处理
病理科常用肿瘤鉴别诊断标记物
免疫组化的临床应用
2、肿瘤的恶性程度与预后判断
近20年来，以P16（宫颈癌）、P504S（前列 腺癌）、Ki-67（肿瘤增殖、预后监测）、 PCNA（肿瘤增殖、预后监测）、P53（癌基 因、预后监测）等为代表的数十种恶性肿瘤 相关抗体相继被广泛应用于肿瘤性质的判断 和预后，从而使恶性肿瘤的辨识更加精确。
2.染色阳性强度和阳性检出率相结合：
阳性细胞数＜25%
－
25%-50%
+
50%-75%
++
＞75%
+++
四、其他常见问题
（三）假阳性、假阴性及背景着色的原因 1、假阳性的原因 ➢抗体与非特异性抗原结合 ➢抗体浓度过高 ➢非特异性吸附 ➢内源性酶的催化作用 ➢人为判断失误 ➢外源性或内源性色素的干扰
（六）孵育方法及时间
环境：特制的湿盒内，避免切片干燥致染 色失败
温度及时间：37℃，1h
延长孵育时间：4℃过夜
（七）显色
两种方法：
（1）3,3’-二氨基联苯胺（DAB） 配制方法及注意事项：
现用现配，配好后30min内使用，作用时间 5min以内；配好后需过滤
DAB TBS（0.05mol/L，pH7.6 ） 30%H2O2（显色前加入）
－
－
抗体稀释度的测定
（2）棋盘法：当一抗、二抗、三抗都未知 稀释度时
二抗稀释度 1:50
一抗稀释度
1:100
1:200
1:100 ++++(++) ++++(+) +++(－)
免疫组化常见问题及其解决办法
免疫组化常见问题及其解决办法1、一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？（1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。
一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
（3）其实，我更赞同后一种说法，由于我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。
2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。
消失这种现象的缘由有：（1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的缘由之一。
解决方法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己试验室的抱负工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简洁的按说明书进行染色。
（2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决方法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，准时提示，避开因遗忘而造成时间延长。
现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要依据染色结果进行调整。
（3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。
配制好的DAB不应存放时间太长，由于在没有酶的状况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种好像节省的方法是不行取的。
DAB的显色最好在显微镜下监控，达到抱负的染色程度时马上终止反应。
不过当染色片太多时或用染色机时，这样做好像不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避开显色时间过长。
（4）组织变干：修复液溢出后未准时补充液体、染色切片太多、动作太慢、遗忘滴液、滴液流失等都是造成组织变干的缘由。
解决的方法是操作要仔细认真，采纳DAKO笔或PAP Pen在组织四周画圈，可以有效的避开液体流失，也能提高操作速度。
免疫组化中经常出现的问题及对策
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。
由于免疫组化染色过程要经过很多步骤和环节，而每一个步骤环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事，这需要病理技术人员和病理医师的密切配合、相互协调、共同努力才能完成。
虽然免疫组化染色可以存在各种问题，但从染色结果看一般可分为两类：无色片(无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。
l 无色片即染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。
这是常规工作中比较常见的现象，有两种可能。
1．1 真阴性结果整个染色过程没有出现问题，组织或细胞中与抗体相关的抗原确实不表达。
1．2 假阴性结果即此阴性结果不是真实的反映。
1．2．1 切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。
出现这种情况，可能是病理医师对切片或抗体的选择错误。
或是技术员选错蜡块，所以获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。
故制作出合格的免疫组化切片不仅是技术员的事，病理医师也起着不可或缺的作用。
1．2．2 染色过程中的某一或某些环节出了问题。
如：①组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；②抗体选用不当，选用了只能用于冷冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；③一抗失效。
虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也会遇到突然失效的情况，抗体长期不用和／或已超过有效期是主要原因；④染色过程中漏掉了某一环节。
如忘记加二抗或三抗。
或用了两次二抗而缺少三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。
有一种简单的方法可避免这种错误，在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上。
再将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上。
观察是否出现棕色。
如果出现则证明三抗和DAB 的配制过程没有错误；如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以旆；如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗或DAB及其配制过程。
这种方法能迅速地帮助我们找出问题的原因；⑤抗体未完全覆盖测试组织，当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织。
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案免疫组化实验虽然看上去非常简单，然而做起来却容易“花样百出”，让实验人员的精神备受摧残。
因此，今天小编在这里跟大家详细介绍一下免疫组化实验的步骤以及常见问题和解决方案，让大家的免疫组化实验更加顺畅。
免疫组化实验主要包括石蜡切片的免疫组化技术(IHC-P)和冰冻切片的免疫组化技术(IHC-F)，今天主要讲的是IHC-P。
实验步骤详解：1，取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。
注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2，切片制备(1)固定将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。
若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。
(2)洗涤材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。
(3)脱水目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
(4)透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。
(5)浸蜡和包埋透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。
先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。
浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。
免疫组化结果判断及常见问题的分析
3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。
4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
免疫组化标准化照片
CK10 ER CD44v6
合格的免疫组化染色切片 是正确判断染色结果的基础和前提
三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
取5个视野，测100个阳性 细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
PCNA
S-P×400 S-P×400
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中 阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （ ＋ ＋ ）
无信号片
CD30
2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡） 一抗与二抗种属连接错误 抗体失效 显色系统不相适配 操作不当，遗漏重要步骤
对策
改善条件，重取材 确定抗体种属无误 不得使用过期的试剂盒 更换适配的显色系统 严格遵守操作规程
无色或浅色片
MCL理想的 CD5着色。所有的 瘤细胞都着色很强。散在的T细 胞着色比瘤细胞深。
MCL的CD5染色不足 (一抗浓 度太低)。 MCL瘤细胞几乎都 没有着色。
3. 染色过弱原因及其对策
染色过弱原因
抗体浓度过低，孵育时间过短 滴加试剂时缓冲液未沥干 过度蛋白封闭 抗原被破坏
室温太低，<15℃
对策
提高浓度，延长时间
滴加试剂前沥干多余水分
缩短封闭时间
新鲜组织及时固定，固定 时间不要超过24小时 适当延长孵育时间
免疫组化技术常见问题及处理方法
contents
目录
• 实验操作问题 • 染色问题 • 仪器设备问题 • 图像分析问题 • 质量控制与标准化问题
01 实验操作问题
抗原修复问题
总结词
抗原修复是免疫组化实验中的关键步骤，处理不当可能导致抗原失活，影响染色结果。
详细描述
抗原修复过程中需注意使用适当的修复液和修复条件，如pH值、温度和时间，以保持 抗原的完整性和活性。修复液的选择和使用方法需根据抗原类型和抗体特异性进行选择
感谢您的观看
背景染色过高
可能是由于抗体非特异性结合或 清洗不彻底造成，可通过增加清 洗次数或使用低浓度的抗体解决。
组织切片染色不均
可能是由于切片厚度、组织处理 不当或抗体分布不均导致，需确 保切片质量并优化组织处理流程。
室间质评问题
不同实验室间染色结果差异大
可能是由于抗体来源、实验操作、仪器设备等不同造成，需建立统一的操作规程和质控标准。
04 图像分析问题
图像分析软件选择问题
总结词
选择合适的图像分析软件是进行免疫组化图像分析的 关键，不同的软件具有不同的特点和适用范围。
详细描述
在选择软件时，需要考虑软件的算法、功能、操作简 便性、准确性以及是否符合实验室需求等因素。常用 的免疫组化图像分析软件包括Image Pro Plus、 ImageJ、CellProfiler等。
总结词
背景染色问题通常是由于非特异性结合或内源性酶的干扰导致的。
详细描述
为减少背景染色，可以尝试增加洗涤次数，以减少非特异性结合；同时，使用内源性酶抑制剂可以有效抑制内源 性酶的干扰。此外，优化抗体稀释比例和使用低速离心技术也可以帮助减少背景染色问题。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫组化常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
①确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
②确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
⑦检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。
需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
⑧检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
⑨检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。
弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：
①标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
②不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
③抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
⑤孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
非特异性染色
①是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
处理的方法为：
灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/m1）加入底物液中，并保持pH值在7.6~8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L
的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素：消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。
具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
②是否选择使用了正确的封闭血清。
电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%-10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。
另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。
最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
③所选择的抗体是否符合试验要求。
因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
④一抗的使用浓度是否过高。
⑤清洗是否充分。
应严格操作规程。
因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/l Tris—HCl，0.15mol/l NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温20，效果更佳。
特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
⑥DBA的使用是否正确。
DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB 试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。
另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。
孵育时间过长也会造成背景染色。
⑦标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。
⑧检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。