HFLC法测定陆英中绿原酸的含量

HFLC法测定陆英中绿原酸的含量

摘要：本研究以陆英为研究对象，对具有抗肝炎活性的化学成分绿原酸进行了提取工艺、含量测定方法的研究。实验结果表明：绿原酸在0.8～40 μg/ml浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9998，平均回收率为96.1%，RSD值为4.5%。该方法准确性、重复性好，为评价陆英质量提供了一个定量依据。

关键词：陆英提取工艺质量评价高效液相色谱法

该文建立了陆英药材中绿原酸的HPLC含量测定的方法，该方法简便、准确、重复性好，为全面评价陆英药材质量提供了定量依据。

1药品、色谱条件及其优化、对照品溶液和供试品溶液的制备

1.1药品

绿原酸对照品，中国药品生物制品检定所提供。

1.2色谱条件

色谱柱：phenomenexC18反相色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)。流动相：(A)乙腈-(B)0.8%甲酸水溶液梯度洗脱：0～12 min：

A7%升至11%，B93%降至89%；

12～49 min：A11%升至25%B89%降至75%。检测波长：326 nm。流速：1.0 ml/min。柱温：35 ℃。进样量：20 μl。

1.3色谱条件的优化

①流动相系统的考察：试验采用乙腈-水系统，由于目标成分为酸性物质，经试验测定，最终确定采用乙腈-0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱。②流速的影响：考察了流速为0.8、1.0、1.2ml/min对分离效果的影响，结果表明流速为1.0ml/min时分离效果最佳。③柱温的影响：考察了柱温为30、35℃对分离效果的影响，结果表明柱温为35℃时分离效果最佳。综上所述，最终确定以采用乙腈-0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为35 ℃。

1.4对照品溶液的制备

分别取绿原酸的对照品适量，精密称定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为

0.402 mg/ml的标准储备液I，备用。再精密量取储备液I 0.10 ml，置5 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为8.04 μg/ml的标准储备液Ⅱ。

1.5供试品溶液的制备

取陆英药材粉末约 1.0 lg，精密称定，至100ml锥行瓶中，加100ml85%甲醇溶液，超声提取1.0 h。抽滤，旋转蒸发至近干，用甲醇转移至10 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤后取续滤液作为供试品溶液。

2结果

2.1标准曲线的绘制

依次分别精密称取绿原酸的储备液I0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml 置于10ml量瓶中；再分别精密称取储备液Ⅱ1.0ml，至10ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成7个不同浓度的标准溶液。分别取上述溶液20μL进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以对照品峰面积A对浓度C(μg/ml)回归分析，得绿原酸的标准曲线，绿原酸的回归方程为：A=5.8×104C-28121(r=0.9998，n=7)。结果表明，绿原酸在0.8～40μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2检测限(LOD)和定量限(LOQ)

检测限是信噪比为3时的被测物浓度，为能从背景信号中区分出被检测物的最低浓度。定量限是信噪比为10时的被测物浓度，是指在保证具有一定可靠性的前提下，能够测定出的样品中被测物的最低浓度。通过重复测量3次求的平均值，RSD平均值小于5%，绿原酸的检测限和定量限分别为1.28ng/ml和3.84ng/ml。

2.3重复性试验

取陆英药材粉末5份，约1.0g，精密称定1.005g。进行HPLC分析，记录色谱图峰面积：412028、389181、390383、412370和419431，RSD=3.4%。

2.4稳定性试验

取陆英药材粉末约1g，精密称定，按“供试品溶液的制备”的方法制备供试品溶液，避光保存，备用。分别在0，4，8，12，24，48h 测试一次，记录色谱峰面积分别为：381583、380548、377956、376437和374985，RSD为0.7%。结果表明所有分析物在常温下，48h内保持稳定。

2.5回收率试验

向含量已知的陆英样品中加入已知量（72.6μg）的混合标准储备液，然后进行提取和HPLC测试，通过测得量和加入量的比值计算回收率。提取回收率考察了3个不同浓度，即分别在标准曲线的高、中、低三个水平，每个试验重复三次，计算平均回收率。结果见表1。方法的平均回收率为96.1%（100±10%），且RSD=4.5%（小于5%），表明本实验建立的方法具有良好的准确度。

3结语

该文考察了提取溶剂的浓度、提取溶剂用量、提取时间三个因素，对提取工艺进行了优化。

考察50%到90%的甲醇溶剂作为提取溶剂对提取效率的影响：称取药材粉末1.00g，分别加入50%、70%、85%和90%的甲醇，超声提取相同时间，平行操作4次，所得峰面积分别为：271254、367806、

414800和424131。结果表明随着甲醇浓度增加，提取效率增加，但同时被提出的脂溶性杂质也增多，干扰目标成分的测定，最终确定85%甲醇溶剂为提取溶剂。以85%甲醇溶剂为提取溶剂，考察溶剂量从50ml到120ml的提取效率。操作过程同上，所得50、100、120ml 的峰面积分别为364216、426583和429823。

可见，随着甲醇浓度增加，提取效率增加，但是100ml和120ml 提取的量相差不多，所以最终确定以85%甲醇100ml为提取溶剂。在确定提取溶剂量和浓度之后，试验考察了从30min到90min提取时间对提取效率的影响。操作过程同上，结果见表2。可见，60min和90min 的提取效率相差不多，最终确定为60min为提取

时间。

因此，综合上述试验结果，确定最佳提取方法为：称取药材粉末1.0 g，加入85%甲醇溶剂100 ml，超声提取1.0 h。综上所述，该方法准确性和重复性较好，为评价陆英中绿原酸的含量提供了一个定量依据。