酵母表达系统
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Buffer A: 1.0 M Sorbitol (山梨醇), 10 mM Bicine（N二羟乙基甘氨酸 ）, pH 8.35 (Sigma), 3% (v/v) ethylene glycol (乙二醇 )
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
pAO815 体外构建多拷贝
线性化质粒
转化宿主细胞
组氨酸缺陷平板 筛选重组子
22
G418 筛选pIC9K 多拷贝
pAO815和pPIC9K
PCR检测 转化细胞中的基因插入
诱导表达 SDS-PAGE检测
23
酵母菌转化
PEG 1000 Transformation Method for Pichia
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1 His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在 大肠杆菌中操作
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)
宿主His4突变，不能合成组氨酸， 在His缺陷培养基上不能生长； 质粒上有His4, 可合成组氨酸， 用His缺陷平板筛选转化菌株。
酵母表达系统 优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 经济 4 快速
1
酵母细胞结构
2
两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统
毕赤酵母
Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris
过去常用
现在多用
3
Pichia pastoris 表达系统
• Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯
， 只 能 是 甲 醇
无 论 在 那 里 交
17
质粒线性化后转化宿主细胞
线性化位点
线性化质粒发生同源 重组的几率提高
18
pAO815和pPIC9K
在Sal I 、Stu I 单切,
在his 4插入（单交换）， 不破坏宿主的AOX1，转 化GS115后产生： His +/Mut+
单交换
同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该 座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换原有基因片 段。
Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35
Filter sterilize and store at -20°C.
24
制备感受态细胞
1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and
一的碳源.
• 易操作,培养容易 • 表达量高, 可达培养液中10 g/L • 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化 • 避免了酿酒酵母的过糖基化问题
4
5
1. Pichia pastoris 的表达载体
胞内表达载体
胞外表达载体
P. pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体6
• To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.
26
Transformation
• 1. 10-50 μg DNA（20 μl液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA）；
13
pAO815 可体外构建多拷贝
14
BamH I：GGATCC CCTAGG
Bgl II：AGATCT TCTAGA
15
4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变 可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长 本身的回复突变为1/108。
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，
室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭
菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀， 液氮快速冷冻， -70°C保存。
25
保持感受态细胞在冰冻状态作转化！
• Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice.
• It is critical to add DNA to frozen cell samples.
8
2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR
9
胞内表达载体, pAO815
10
源自文库
胞外表达载体, pIC9K
11
pPIC9k, 胞外表达载体
12
3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝
因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低
未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低
16
转化后细胞的甲醇利用能力
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
转化后对甲醇的利用
KM71
AOX1
Bgl II Sal I Stu I
甲
甲
、醇 高
切醇 低
切
利 用
利 用
GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上 交换的位置是否破坏宿主的AOX1
主低换
没 有
利 用 ， 因 为 宿
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
pAO815 体外构建多拷贝
线性化质粒
转化宿主细胞
组氨酸缺陷平板 筛选重组子
22
G418 筛选pIC9K 多拷贝
pAO815和pPIC9K
PCR检测 转化细胞中的基因插入
诱导表达 SDS-PAGE检测
23
酵母菌转化
PEG 1000 Transformation Method for Pichia
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1 His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在 大肠杆菌中操作
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)
宿主His4突变，不能合成组氨酸， 在His缺陷培养基上不能生长； 质粒上有His4, 可合成组氨酸， 用His缺陷平板筛选转化菌株。
酵母表达系统 优点
1 属于真核生物,可进行翻译后修饰,如糖基化 2 操作容易 3 经济 4 快速
1
酵母细胞结构
2
两种酵母表达系统
酿酒酵母表达系统
毕赤酵母
Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris
过去常用
现在多用
3
Pichia pastoris 表达系统
• Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯
， 只 能 是 甲 醇
无 论 在 那 里 交
17
质粒线性化后转化宿主细胞
线性化位点
线性化质粒发生同源 重组的几率提高
18
pAO815和pPIC9K
在Sal I 、Stu I 单切,
在his 4插入（单交换）， 不破坏宿主的AOX1，转 化GS115后产生： His +/Mut+
单交换
同源重组基因转移法 ：是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该 座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换原有基因片 段。
Buffer C: 0.15 M NaCl, 10 mM Bicine, pH 8.35
Filter sterilize and store at -20°C.
24
制备感受态细胞
1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and
一的碳源.
• 易操作,培养容易 • 表达量高, 可达培养液中10 g/L • 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化 • 避免了酿酒酵母的过糖基化问题
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1. Pichia pastoris 的表达载体
胞内表达载体
胞外表达载体
P. pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体6
• To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time.
26
Transformation
• 1. 10-50 μg DNA（20 μl液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA）；
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pAO815 可体外构建多拷贝
14
BamH I：GGATCC CCTAGG
Bgl II：AGATCT TCTAGA
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4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
宿主的histidinol dehydrogenase gene (his4) 突变 可以在完全培养基YPD和含组氨酸的基础培养基上生长 在表达质粒转入后才能在组氨酸缺陷培养基上生长 本身的回复突变为1/108。
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，
室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭
菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀， 液氮快速冷冻， -70°C保存。
25
保持感受态细胞在冰冻状态作转化！
• Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice.
• It is critical to add DNA to frozen cell samples.
8
2. CONSTRUCTION OF THE VECTOR
9
胞内表达载体, pAO815
10
源自文库
胞外表达载体, pIC9K
11
pPIC9k, 胞外表达载体
12
3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝
因为未线性化的环状质粒之间发生同源 重组的几率非常低
未线性化的环状质粒发生同源 重组的几率非常低
16
转化后细胞的甲醇利用能力
GS115
AOX1正常，Mul+
KM71
AOX1被破坏， MulS
转化后对甲醇的利用
KM71
AOX1
Bgl II Sal I Stu I
甲
甲
、醇 高
切醇 低
切
利 用
利 用
GS115取决于质粒在宿主细胞基因组上 交换的位置是否破坏宿主的AOX1
主低换
没 有
利 用 ， 因 为 宿