_免疫检验自动化仪器分析

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(一)免疫比浊分析的影响因素 1.抗原抗体比例 2.抗体的质量
3.增浊剂的使用
4.伪浊度 5.入射光光源和波长 6.结果报告中的计量单位 7.标准曲线制备与质量控制
(二)临床应用
免疫比浊分析法主要用于检测免疫球蛋白IgG、IgA、 IgM、κ链、λ链、免疫球蛋白亚类;补体C3、C4;血 浆蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白
射光的波长和强度;dn/dc为校正因子,反映了溶液折
射指数和颗粒浓度的变化;M为颗粒分子量;c为浓度; N为阿佛加德指数;γ为颗粒到检测器的距离;θ为散 射光与入射光的夹角(散射夹角)。
(二)定时散射比浊法(fixed time nephelometry)
定时散射比浊法是在保证抗体过量的情况下,加入
待测抗原,此时反应立即开始,在反应的第一阶段,
溶液中产生的散射光信号波动较大,所获取的信号
计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法 是避开抗原抗体反应的不稳定阶段,即散射光信号 在开始反应7.5s~2min内的第一次读数,专门在抗 原抗体反应的最佳时段进行读数,将检测误差降到
最低。
定时散射比浊法测定原理示意图
酶(α1-AT)、β2-微球蛋白(β2-MG)、转铁蛋白(TRF)、 铜蓝蛋白(CER)、结合珠蛋白(HP)、,C-反应蛋白 (CRP)、载脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、类风湿 因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治疗性药物浓度等。
第二节自动化学发光免疫分析系统
自动化发光免疫分析仪主要由样本盘、试剂
顺磁性微粒子为固相载体,用AMPPD作为化学发
光剂进行测定的自动化仪器。
AMPPD发光反应原理示意图
仪器测定技术要点
• • • • 抗原抗体结合 洗涤、分离 加入AMPPD发光剂 信号检测
碱性磷酸酶标记的化学发光免疫测定示意图
Access全自动酶标记化学发光免疫分析仪
UniCel™DxI 800
液中反应,形成小分子免疫复合物(<19S),在增浊剂(如PEG、
NaF等)的作用下,迅速形成免疫复合物微粒(>19S),使反应 液出现浊度。在抗体稍微过量且固定的情况下,形成的免疫复 合物量随抗原量的增加而增加,反应液的浊度亦随之增大,即 待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
一、免疫透射比浊法
(一)原理: 一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液
磁性微粒直径2.8µ m,表面的凸凹使包被面积放大。磁性微 粒体积小,悬浮于反应体系中,形成均一稳定的液相,在磁 场中易于分离。
仪器测定技术要点
• 抗原抗体结合 • 电化学发光反应 • 光信号检测 • 检测完毕
电化学发光免疫测定示意图
电化学发光免疫测定工作示意图
AMPPD特性
碱性PH环境下,非酶解性的水解很低 热稳定性好 PH9时酶解速度最快,PH9.5时信噪比 最低 发光为持续型,15min达到高峰, 60min内强度维持不变
线拟合,制备剂量-反应曲线,由计算机处理,计
算出抗原浓度。
(三)方法评价
优点: 灵敏度高,稳定性好,操作简便,结果准确 不足: ①抗体用量较大; ②溶液中存在的抗原-抗体复合物分子应足够大 ③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段,检 测需在抗原抗体反应达到平衡后进行,耗时较长。
二、免疫胶乳比浊法
盘(盒)、温育反应系统、固相载体分离清洗系统、
信号检测系统和计算机数据处理、控制系统组
成。
一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪
吖啶酯标记的化学发光免疫分析仪是一种用发光剂直接标 记抗体或抗原的一类免疫分析法。该仪器利用化学发光技术 和磁性微粒子分离技术,以吖啶酯为化学发光剂,以细小的 顺磁性微粒为固相载体。其测定原理与双抗体夹心法、双抗 原夹心法和竞争结合法等相同。
本法敏感度大大高于普通比浊法,可达ng/L水平, 操作简便,易自动化;血清中的类风湿因子(RF)可 与IgG Fc段结合,使IgG致敏胶乳颗粒出现非特异 性凝集,用F(ab′)2片段代替IgG既可消除此干扰,
又可克服IgG致敏胶乳的自凝现象;免疫胶乳轻度
自凝或抗体活性降低会严重影响结果。
三、免疫散射比浊法
成免疫复合物的量(不是免疫复合物累积的量),
连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射
光信号联系在一起,形成动态的速率散射比浊法,
每项检测仅1~2min即可完成。
仪器测定技术要点
• 开启机器,进行定标 • 反应阶段
• 抗原过量检测
抗原抗体复合物形成的速率 累计时间(s) 形成IC总量 速率 5 10 15 20 25 30 8 13 25 60 150 230 - 5 12 35 90 80 累计时间(s) 形成IC总量 35 40 45 50 55 60 300 360 415 450 480 500 速率 70 60 55 45 30 20
(一) 原理 粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光 线照射后,微粒子对光线产生反射和折射而形成散 射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒 的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等 因素密切相关,其公式如下:
Iθ=
I0[4π2(dn/dc) 2 Mc(1+cosθ)] Nγ2λ4
式I θ中为与入射光成θ角处散射光强度;λ和I0为入
(一)原理:
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒(一般为0.2 μm), 在遇到相应抗原时,胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合,引起胶乳 颗粒凝聚 ,使透射光和散射光即出现显著变化。如图所示:a为单 个胶乳颗粒不阻碍光线透过,b为抗原抗体结合形成的凝聚胶乳大颗 粒使透射光减弱或散射光增强。
(二)方法评价
Байду номын сангаас
磁微粒技术
磁微粒标记抗体
磁微粒在 电磁场中分离
Y
顺磁性微粒示意图
直接化学发光的机理
双抗体夹心法
磁微粒
抗体
+
被测抗原
+
带丫啶 酯标记 物抗体
(1) 加入酸性H2O2 (pH<10)
(2) 加入碱 (pH>10)
发光
冲洗后
仪器测定技术要点
• 抗原抗体结合 • 洗涤、分离 • 加入氧化剂发光
• 信号检测
时,被其中的免疫复合物微粒吸收、反射和折射而 减弱,在一定范围内,吸光度与免疫复合物量呈正 相关,而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和 抗体的量呈函数关系。与已知浓度的抗原标准品比
较,可确定标本中抗原含量。
(二)仪器工作过程
1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。 2.将待测标本和标准抗原溶液(5个浓度抗原标准 品)与适当过量的抗血清混合,在一定条件下,抗 原抗体反应完成后,在340nm处测定各管吸光度。 3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲
AMPPD发光图谱
相对 发光 单位
00
5
10
55
60
时间(分钟)
发光图谱连续,稳定。 允许多次 记数,取均值作为结果。
ACCESS分析简要流程
洗涤,磁 性分离, 去除未结 合成分
加入 标本, 磁性微粒子, 孵育 试剂 促进抗原 抗体结合
加入发光 底物,产 生信号
孵育,促使 信号产生
检测信号
ACCESS
系统性能
试剂容量 • 24个试剂位
•自封闭,多层覆膜试剂盒
• 机上试剂冷藏装置 • 试剂保质期长
ACS:180 SE 全自动化学发光免疫系统
ACS:180 SE 独特的优势 直接标记的化学发光 - 快速
强烈的直接发光在一秒内完成。ACS分析仪的光度计在整个 发光的前,中,后过程中进行500次连续读数。所以出第一个 结果的时间很快并可获快速急诊报告。
剂),由酶催化和分解底物发光,通过光信号的强弱来进行被测
物的定量。 常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶 (ALP),常用的发光底物有鲁米诺、AMPPD和4-MUP等。
㈠辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析仪 该仪器采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗 原或抗体、以塑料锥形小管为固相载体,鲁米 诺为化学发光剂,还利用增强剂使化学发光强 度增加、时间延长。
专利,独有技术 磁性微粒子技术:d<7 超声波清洗系统:交叉污染率<1ppm 多层覆膜试剂盒:确保稳定性12-18个月 机上自备试剂冷藏系统:试剂保存于三度 磁性清洗分离技术:保证高灵敏度 随机加入消耗品
与包被管或包被珠相比反应表 面积增大50倍,增加了抗体的 用量,并因分散悬浮于液体( 称为类均相),大大加快了速 度。 又因为是可磁化颗粒,便于自 动化和提高B/F分离效率,降 低了本底,提高了灵敏度。
电化学发光剂发光的反应原理
三联吡啶钌[Ru(bpy)3] 2+分子结构图
• 时间分辨荧光免疫分析仪是用镧系元素标记抗原或 抗体作为示踪物,与时间分辨测定技术结合而制造 出来的一种自动化分析仪。荧光偏振免疫测定是一 种均相荧光免疫测定法,常采用抗原抗体竞争反应 原理,适用于小分子半抗原(如药物浓度)的检测。 • 全自动酶联免疫分析仪是由多个模块组成,用一台 计算机、一套操作系统实现了从标本稀释、加样到 酶标板孵育、洗涤、加试剂、再孵育、洗涤、酶标 板读数和结果打印自动化。其结果是减轻了劳动强 度,缩短了试验时间,提高了工作效率,为全面实 现实验室自动化打下了基础。
抗原抗体反应速率的动态变化
IMMAGE全自动特定蛋白分析仪
(三)方法评价
散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法,本
法自动化程度高,具有快速、灵敏、准确、精密
等优点。采用抗原过量检测方法,保证了结果的 准确性。但仪器和试剂价格比较贵, 对抗体的质 量要求很高。
四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用
学引发的特异性化学发光反应,它包括电化学和化学发光两
个过程。电化学发光免疫分析仪是采用电化学发光技术,生 物素放大技术,以顺磁性微粒为固相载体,用三联吡啶钌标
记抗原或抗体,三丙胺(TPA)为电子供体,而设计的一种自
动化分析仪器。电化学发光稳定、持续时间长,易于控制并 可根据待测分子的大小设计成多种反应模式如夹心法、竞争 法等。
4-甲基伞型酮磷酸盐(4-MUP)反应原理示意图
仪器测定技术要点
• • • • 抗原抗体结合 洗涤、分离 加入底物4-MUP 信号检测
碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫测定示意图
AXSYM全自动酶标记荧光免疫分析仪
AIA-1800型全自动酶标记荧光免疫分析仪
三、 电化学发光免疫分析仪
电化学发光免疫分析(ECLIA)是一种在电极表面由电化
1. 仪器测定技术要点
(1) 抗原抗体预反应阶段 (2) 反应阶段 (3) 信号检测
2. 抗原过量检测
(1) 抗体适当过量 (2) 对抗原过量进行阈值限定
BN ProSpec全自动特定蛋白分析仪
(三)速率散射比浊法(rate nephelometry) 速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的动力学测 定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形
IMMULITE 2000型全自动酶标记化学发光免疫分析系统
(三)碱性磷酸酶标记的微粒子荧光免疫分析仪
该仪器以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,以塑料微粒为
固相载体包被抗体(或抗原),以4-甲基伞型酮磷酸
盐(4-MUP)作为酶促反应的荧光基质(底物), 底物被酶水解后,脱磷酸根基团,形成4-甲基伞型酮 (4-MU),用360nm激发光照射,发出450nm的荧光。
鲁米诺是一种还原剂,在碱性溶液中被H2O2氧化产生鲁米诺衍生物 (激发态)。它以光量子辐射形式返回基态时,发出微绿色可见光。
鲁米诺增强化学发光的原理
辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫测定示意图
Vitros ECi全自动增强化学发光酶免分析仪
㈡ 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪
该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体,以
吖啶酯标记化学发光免疫测定示意图
ACS:180 SE和ACS∶CENTAUR化学发光免疫分析仪
ACS:180 SE
ACS∶CENTAUR
ci8200 i2000sr
二、酶联发光免疫分析仪
酶联发光免疫分析仪是用参与催化某一化学发光或荧光反 应的酶来标记抗原或抗体,在抗原抗体反应后,加入底物(发光
第二十章 免疫检验自动化仪器分 析
免疫检验自动化 (automation of immunoassays) 是将免疫学反应检测过程中的取样、加试剂、混合、 温育、固相载体分离、信号检测、数据处理、打印报 告和检测后的仪器清洗等步骤由计算机控制,自动化 进行。
第一节 自动化免疫浊度分析系统
免疫浊度分析的基本原理是:抗原、抗体在特定的电解质溶
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