巨噬细胞功能检测

单核－巨噬细胞吞噬功能测定

单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。

小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）

1、原理

巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。

2、方法

(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当

浓度备用(1~2×106／ml)。

(2)被吞噬物的制备

1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。

2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。

3、操作

取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。

吞噬率％=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％

吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞总数/100个巨噬细胞**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)

（三）小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体内法）

[原理]

巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，通常选用鸡红细胞作为吞噬颗粒，将其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬细胞则将鸡红细胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可见鸡红细胞被吞噬的现象，计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数可判断其吞噬功能。

[材料]

1．1％鸡红细胞悬液。

2．小白鼠。

3．6％可溶性淀粉肉汤肉汤培养液100 m1加入可溶性淀粉6 g，混匀后煮沸灭菌

4．瑞氏染液。

5．解剖小器械一套、无菌注射器、显微镜等。

[方法]

1．试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤1 ml。

2．试验当天于每只小鼠腹腔内注射0.5 ml 1％鸡红细胞悬液，并轻揉腹部。

3. 注射后30 min，将小鼠处死、取腹腔液涂片并行瑞氏染色。

4．油镜观察涂片。

[结果观察]

镜下可见吞噬细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，而核则染成蓝色(鸡红细胞有细胞核)。计数100个吞噬细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。

[注意事项]

1．小白鼠腹腔注射时注意不要刺伤内脏。

2．如小鼠腹腔液过少时，可注入适量的生理盐水。

3．被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短则尚未被吞噬，因此须掌握好时间。