(完整版)大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab)

2. SOC 培养基除含有 20 mmol/L 葡萄糖外，其他成分与 SOB 培养基相同。 SOB 培 养基经高压灭菌后冷至 60℃或以下，加 20 ml 除菌的 1 mol/L 葡萄糖溶液（ 1 mol/L 葡萄 糖溶液的配制方法是：用 90 ml 去离子水溶解 18 g 葡萄Biblioteka Baidu，完全溶解后，用去离子水定 容至 100 ml ，用 0.22 um 滤器过滤除菌）
5．弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约 中。 4 C，4000rpm，离心 15 分钟。
500ml 冰水
6．弃上清，往离心管中加入少量 10%甘油 (灭菌，预冷 )，重悬菌体，再加 10% 甘油至终体积约为 20ml。 4 C, 4000rpm, 离心 10min 。
7．小心弃去上清（沉淀可能会很松散 !），加入 2ml 10%甘油 (灭菌，预冷 )重悬 浮细胞。
8．将悬浮菌液以 200ul/管分装于 1.5ml 的 Ep 离心管中，在液氮中快速冷冻后， 于 -70 C 冰箱中保存。
9．检测转化效率：取 100 l 新鲜制备的感受态细胞，加入 0.01ng 已知浓度的 plasmid DNA ，电转化后，将重悬在 1ml SOC 培养液并复苏的细胞分别取 10 l (1%)和 100 l (10%) 涂板，估测转化效率。
[用 5 N NaOH 调 pH 值至 7.0]
20 g 5g 0.5 g 10 ml 5 ml
Tryptone Yeast Extract NaCl KCl (250 mmol/L) MgCl2 (2 mol/L)
20 ml Glucose (1 mol/L)
Note: 1. 溶液使用前，加入灭菌的 MgCl 2;
* Optimal efficiency is ca. 1X10 8 cfu/ gμDNA for general cloning. ** For library transformation, efficiency with ca. 1X10 9 cfu/ gμDNA is required.
感受态细胞制备简要流程： 收集细胞 冰水冲洗细胞 2 次 10% 甘油冲洗细胞 1 次 重悬细胞在 10% 甘油 分装
2．将菌液在冰上预冷 30 分钟。同时，开启离心机，预冷至 4 C。
3．随后将菌液分装到 250ml 或 500ml 预冷的离心瓶中， 4 C，4000rpm 离心 15 分钟。
4．弃上清液，先用少量（如 20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加 水稀释至离心瓶的 2/3 体积，充分悬起细胞 （可以用手握住瓶体上部震荡！ ）。 4 C， 4000rpm 离心 15 分钟。
3. 准备几瓶灭菌水 （总量约 1.5 升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细
胞用。
第二天：
1．取 2-5ml 过夜培养液，接入 500ml LB ( 或 2XTY) 液体培养基中 , 控制起始 OD600 = 0,03-0,05。 37 C，220rpm，振摇 2-4 小时，每半小时测一次 OD，当 OD 值达到 0.4 时，停止培养。
1000ml
5 g yeast extract 10 g tryptone (or peptone) 10 g NaCl 16 g Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl
[用 5 N NaOH 调 pH 值至 7.0]
4g 1g 0.1 g 2 ml 1 ml 4 ml
二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒文库 ]： 1．从 -80 C 冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。 2．将无菌的电击杯置于冰上预冷。 3．将解冻的感受态细胞按照 40～ 100ul/管转移至预冷的 1.5ml 的离心管中，小
心混匀，冰上放置。 4．取 1-2 μl 纯化的质粒或克隆连接产物于 1.5ml 的离心管中，冰上放置 10min。
极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。 7．将电击杯推入电转化仪，按一下 pulse 键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速
加入 2X 500 l 的 SOC 液体培养基，重悬细胞后，转移到 1.5ml 的离心管中。 8．37 C，220－ 250rpm 复苏 1 小时。 9．离心，涂板，置于 37 C，过夜培养，次日查看转化结果。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
(Jin Quan-Wen Lab at XMU)
一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：
第一天：
1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落， 接种入盛有 5ml LB 液体培养基的培养管中， 可以准备两管。 37 C，220rpm，培养过夜（ 14-16 个小时）。
2. 高温灭菌大的离心瓶（ 250-500ml）和几个 50ml 离心管，以备第二天离心收 集细菌用。
几种可以选用的细菌培养基：
LB 2 TY
SOC
200ml
1 g yeast extract 2 g tryptone (or peptone) 2 g NaCl 3.2 g Tryptone 2 g Yeast Extract 1 g NaCl
500ml
2.5 g yeast extract 5 g tryptone (or peptone) 5 g NaCl 8 g Tryptone 5 g Yeast Extract 2.5 g NaCl
[加入的 DNA 体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！ ] 5．打开电转仪 [Bio-Rad Gene Pulser System，] 调至 Manual，调节参数设置为 25 μF,
200 OHMs, 电压为 2.0 kV [ 这些参数设置可以根据经验略作调整 ] 。 6．将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电
三、电击杯的清洗和保存： 1. 用清水将 用过的 电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入 75%酒精冲洗。 2．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗 2~3 遍，然后用 1ml 的枪吸取超纯水反复吹打电
击杯 10 次以上。 3．加入无水乙醇 1-2ml 于电击杯中，浸泡 5 分钟。 4．弃去无水乙醇，将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。 5．将清洗并干燥好的电击杯加上盖子，存放备用。
Tryptone Yeast Extract NaCl KCl (250 mmol/L) MgCl 2 (2 mol/L) Glucose (1 mol/L)
[ 用 5 N NaOH 调 pH 值至 7.0]
10 g 2.5 g 0.25 g 5 ml 2.5 ml 10 ml
Tryptone Yeast Extract NaCl KCl (250 mmol/L) MgCl 2 (2 mol/L) Glucose (1 mol/L)